Fino ad ora abbiam parlato di geni più o meno
wild-type, non abbiamo mai parlato di mutagenesi. I mutanti di cui
abbiamo parlato erano ottenuti attraverso la genetica classica,
che prevede di trattare con agenti mutageni una certa popolazione,
selezionando per un certo fenotipo ed isolando quindi il gene. Si
tratta quindi di una mutagenesi in vivo, ed è legata al tipo
di cellule. In genere viene fatta su organismi semplici, che si
riproducono in modo controllato e di cui si conosce bene la genetica,
la biochimica ecc. (lievito, E.coli, drosophila).
Qui ci occuperemo di reverse genetic: partiremo dai geni e in vitro
introdurremo delle mutazioni, una volta introdotta la mutazione
reintroduciamo il gene nell’ospite, e andremo a valutare il
fenotipo.
Quali sono le tecniche di mutagenesi in vitro?
Le tecniche possono essere tre+1:
1. Mutagenesi Random,
casuale e casuale localizzata
2. Mutagenesi che porta a ristrutturare e modificare segmenti di
DNA tramite delezioni, inserzioni, linker scanning
3. Mutagenesi
sito specifica
4. Mutagenesi con
PCR
Tutte queste metodiche hanno uno schema generale,
questo schema prevede:
Isolamento del gene che viene clonato in un vettore (plasmidico
o fagico)
In vitro mutagenesi (in cui si sviluppanole varie differenze);
Introduzione dei plasmidi in E.coli e selezione con Ampicillina;
A questo punto posso:
isolare i singoli trasformanti, e quindi analizzare i singoli plasmidi
uno a uno;
oppure utilizzare tutti i plasmidi per costruire una genoteca di
mutanti, per cui tutti i plasmidi vengono fatti crescere, ritrasformo
ospiti opportuni per costruire la genoteca.
In entrambi i casi alla fine devo avere un saggio che mi permette
l’individuazione della mutazione (saggi di funzionalità).
Una volta isolato il gene mutato viene introdotto nell’ospite
originale e si va a vedere l’effetto (--> fenotipo).
La differenza iniziale fra mutagenesi random e mutagenesi
sito-specifica è che in quella random non ho bisogno di grosse
informazioni a priori sul mio prodotto (il gene), nel caso della
mutazione sito-specifica invece io devo avere informazioni sulla
funzione del gene, in modo tale che io possa scegliere in modo mirato
il tipo di mutazione da introdurre.
Il primo tipo di mutagenesi, proprio com’è
impostata, porta ad un grande n° di mutanti (è random…)
quindi devo avere anche un sistema rapido di screening (non posso
sequenziare tutti i mutanti che escono!…).
Nel caso della mutagenesi sito-specifica ho invece come risultato
un ristretto n° di mutanti, e in alcuni casi anche uno solo,
quindi non necessito di questo screening rapido, ma è meglio avere
uno screening specifico.
