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brunacell
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 12:05:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di brunacell Invia a brunacell un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve,
spero che qualcuno possa aiutarmi.
Vorrei sapere come posso confrontare le sequenze di due primers con la sequenza nucleotidica del mio gene.
Andando sullo specifico:da un articolo ho trovato dei primers per il fattore XIII (ma questo lavoro devo farlo anche per altri fattori),vorrei trovare corrispondenza tra questi e le sequenza genica,sono entrata su pubmed e da lì su FASTA, penso di aver trovato la sequenza nucleotidica giusta ma non riesco a trovare le sequenze dei due oligo.
Cosa sbaglio?
Per favore qualcuno mi risponda il più velocemente possibile.
Grazie.

marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 17:23:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cosa sbagli è un pò difficile dirlo. Prova a fare un blast con il primer fw, magari ti esce la sequenza che volevi (ricorda che per trovare il primer rv devi usare la sequenza capovolta complementare)
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dallolio_gm
Moderatore


Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna


2445 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 17:54:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di dallolio_gm  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di dallolio_gm Invia a dallolio_gm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Devi trovare un tool che ti permetta di fare una 'in silico pcr'.

C'e' questo classico di ucsc, ma si applica all'intero genoma (cosi' vedi se avrai prodotti spuri):
- http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

Oppure cerca su internet/pubblicazioni un tool apposito.
Appena ho tempo ti rispondo meglio :).
Comunque, vedi se trovi qualcosa di interessante nel topic dei primers:
- http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1655

Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-)
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8383 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:07:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh la prima cosa comunque è fare un blast per vedere se riconosce la tua sequenza o altro!
Poi c'è un programmino molto semplice da usare in cui metti la tua sequenza, i primers e glieli fai cercare sulla sequenza. Poi puoi anche selezionarli e ti dice la grandezza del frammento amplificato!
Puoi anche fare la ricerca con 1 o più mismatch.
Si chiama AnnHyb è free e rilasciato secondo la "GNU General Public License" (cosa che piacerà sicuramente a dallolio_gm ).
Io stavo usando ancora una versione vecchissima, ma è da poco uscita l'ultima versione, la scarichi qui!
L'utilizzo è davvero intuitivo, ma se hai bisogno scrivi!

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MaryngA
Nuovo Arrivato


Prov.: Parma
Città: Parma


29 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:45:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryngA Invia a MaryngA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare... e detto fra noi secondo me molta gente che dovrebbe refertare gli articoli non controlla i primer perchè a me è capitato più di una volta o di non trovarli proprio nella sequenza o trovarli ma diversi (e non mi riferisco all'inserimento di siti di restrizione).
ciaoooo
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dallolio_gm
Moderatore


Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna


2445 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 19:25:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di dallolio_gm  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di dallolio_gm Invia a dallolio_gm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA

Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare...


Potrebbe non funzionare:
- se ti dimentichi di cambiare maiuscole/minuscole
- se ci sono delle 'N' o delle basi indicate ambiguamente
- se ci sono degli 'a capo' o degli spazi (in genere le sequenze fasta vanno a capo ogni 80 caratteri)

Inoltre, essendo un metodo 'manuale', non e' riproducibile, ovvero anche se lo fai, non puoi dimostrare di averlo fatto correttamente.

Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-)
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MaryngA
Nuovo Arrivato


Prov.: Parma
Città: Parma


29 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 19:54:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryngA Invia a MaryngA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si si basta stare 1 pò all'occhio diciamo...e tenere presenti queste cose... al massimo cercare non tutta la sequenza del primer ma solo un pezzo e poi guardare l'intorno... le sequenze in fasta sono in maiuscolo e se nella ricerca scrivi in minuscolo li trova lo stesso inoltre gli spazi in fasta non c sono bisogna stare eventualmente attenti alla 'a capo', poi per quel che riguarda le N personalmetnte in banca dati non le ho mai trovate solo nei sequenziamenti
ah poi è meglio impostare courier come carattere
Io così facendo mi son sempre trovata bene anche perchè essendo già in word posso segnare sottolinenando evidenziando ecc dove annealano i primer di quante paia basi sarà l'amplificato (conteggio parole)e così via
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8383 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 20:04:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA

Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare...


Sono d'accordo con dallolio!!!
E poi comunque è un metodo un po' barbaro, se esistono programmi per farlo, che ripeto sono free, perchè non utilizzarli?
Inoltre appunto nel caso i primers non siano esattamente complementari alla sequenza ma ci siano dei mismatch il programma te li trova comunque e ti indica in quale base c'è il mismatch! Farlo manualmente sarebbe impensabile, dovresti provare tutte le possibili combinazioni!

Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA

... a me è capitato più di una volta o di non trovarli proprio nella sequenza o trovarli ma diversi ...

Appunto per quello è bene fare un blast!!!

Il caso di trovare in letteratura primers che non siano completamente complementari alla sequenza non poi così raro (anche a me è capitato spesso), aggiungere dei mismatch all'interno del primer può servire per migliorare la stabilità del primer (impedire che formi hairpin o dimeri, cambiare la sua Tm...) e comunque se la sequenza è abbastanza specifica e non si attacca da altre parti non inficia la riuscita della PCR. Anche in questo caso è fondamentale fare un blast dopo averli disegnati, e ovviamente non cambiare i nt al 3'!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8383 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 20:18:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA

si si basta stare 1 pò all'occhio diciamo...e tenere presenti queste cose... al massimo cercare non tutta la sequenza del primer ma solo un pezzo e poi guardare l'intorno... le sequenze in fasta sono in maiuscolo e se nella ricerca scrivi in minuscolo li trova lo stesso inoltre gli spazi in fasta non c sono bisogna stare eventualmente attenti alla 'a capo', poi per quel che riguarda le N personalmetnte in banca dati non le ho mai trovate solo nei sequenziamenti
ah poi è meglio impostare courier come carattere
Io così facendo mi son sempre trovata bene anche perchè essendo già in word posso segnare sottolinenando evidenziando ecc dove annealano i primer di quante paia basi sarà l'amplificato (conteggio parole)e così via

Tutte cose che fai in automatico con il programma!!!
E molto più velocemente credimi!
Se comunque poi ci tieni ad avere anche i primers indicati in Word, basta che guardi a che basi si attaccano e li evidenzi successivamente in Word!
Ah funziona anche il fantastico "Copia e Incolla", così hai già la tua bella sequenza in word con i numerini di fianco, senza stare a metterli a mano , con vari trucchetti , o con tools appositi per word (esistono anche quelli e ti semplificano la vita!!!)
Perchè non provi e poi vedi il tempo che risparmi!!!

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1718 Messaggi

Inserito il - 06 novembre 2008 : 09:14:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Poi c'è un programmino molto semplice da usare in cui metti la tua sequenza, i primers e glieli fai cercare sulla sequenza. Poi puoi anche selezionarli e ti dice la grandezza del frammento amplificato!
Puoi anche fare la ricerca con 1 o più mismatch.
Si chiama AnnHyb è free e rilasciato secondo la "GNU General Public License" (cosa che piacerà sicuramente a dallolio_gm ).


Eee...questo non lo conoscevo...c'è sempre da imparare!!!

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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brunacell
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 06 novembre 2008 : 10:15:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di brunacell Invia a brunacell un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille per le vostre risposte.
Proverò a mettere in pratica i vostri consigli e vi farò sapere.
Buon lavoro e buona giornata.
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