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Autore

Discussione

bombergigi
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2008 : 11:50:23

salve a tutti, mi sono appena iscritto a questo forum e spero qualcuno mi possa aiutare.
non sono un biologo molecolare, ma per motivi lavorativi nel prossimo progetto dovr� avere a che fare con queste cose, o almeno riuscire a capire di cosa si tratta quello che leggo, quindi...

credo di aver capito che il TOPO Ta Cloning sia un plasmide ingegnerizzato al quale viene inserito il prodotto di PCR che voglio...
Credo anche di aver capito che una miniprep � un processo di isolamento plasmidico...
la mia domanda qual'� la sequenza o l'iter di questi procedimenti?

grazie

miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2008 : 12:09:59

allora

quando cloni....
cerco di descrivertelo in maniera elementare senza usare termini troppo scientifici
non so bene se sei biologo o no

allora
hai una soluzione che contiene plasmidi con il tuo inserto e plasmidi senza il tuo inserto (parlo del prodotto PCR)
questo normalmente lo ottieni dopo la reazione di ligasi (T4 ligasi)

a questo punto per scoprire quale e' il plasmide con l'inserto
trasformi dei batteri.... li piastri... ottieni colonie e fai miniprep dalle singole colonie

e ottieni la miniprep positiva (quella con inserto PCR)

spero ora ti sia piu chiaro

bombergigi
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2008 : 12:39:40

grazie sei stato chiaro. spero.
non sono un biologo e credo che questo sia solo il primo di una lunga serie di dilemmi...ahaa

infatti...
come si fa a vedere se poi la miniprep � positiva?
ciao

morgan79
Utente Junior

Prov.: Bari

143 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2008 : 14:07:26

http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=10756

le positive le riconosci mediante estrazione del DNA plasmidico e corsa su gel di agarosio, colony PCR o sequenziamento con i primer universali che di solito vengono forniti col vettore

il sapere non � sufficiente, bisogna applicare; il volere non � sufficiente, bisogna fare

Patrizio
Moderatore

Citt�: Barcellona

1912 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2008 : 22:59:54

Citazione:
Messaggio inserito da miky76

questo normalmente lo ottieni dopo la reazione di ligasi (T4 ligasi)

se e' topo... in questo caso non serve