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mari11
Nuovo Arrivato

Prov.: Catania


14 Messaggi

Inserito il - 09 gennaio 2006 : 16:41:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mari11  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di mari11 Invia a mari11 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
è la prima volta che scrivo in qst forum...
innanzitutto vorrei complimentarmi!
vorrei fare maggior chiarezza sulla real time pcr o pcr quantitativa!
ho capito che la sequenza da amplificare dovrebbe essere rivelata dalla sonda e in base alla fluorescenza emessa si risale alla concentrazione del prodotto amplificato.
1) non ho capito il ruolo del quencher: xkè spegne il reporter? cos'è il quencher? è una sequenza marcata?
2) reporter e quencher sono collocati agli estremi della sonda rispettivam al 5' e al 3'?
3) qst tecnica serve solo a quantificare dopo che l'oligonucleotite è stato amplificato? o serve anche ad amplificare?

4)che differenza c'è e che relazione corre tra real time e RT-PCR (reverse transcriptase PCR)?

penso che abbiate capito che mi servono solo nozioni teoriche almeno x adesso.. chissà in futuro!!

come libro di testo sto usando il wilson e walker... a qst riguardo mi sembra un tantino carente !!
a presto

Marianna
Utente Junior




146 Messaggi

Inserito il - 09 gennaio 2006 : 17:34:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La Real Time PCR è una PCR in cinetica in cui l’amplificazione ed il rilevamento dell’amplificato avvengono nello stesso momento. Questo è possibile grazie all’introduzione all’interno della reazione di una molecola fluorescente, che ci da la possibilità di seguire la reazione da un punto di vista visivo, grazie all’ausilio di appositi software.

In Real Time PCR, il meccanismo di rivelazione di segnale di fluorescenza su basa sul principio del FRET Quencing. FRET è una sigla che sta per Fluorescence Resonance Energy Transfer (Theodor Forster) e si basa sulla presenza di una molecola R, che viene detta Reporter, che viene eccitata da una radiazione di opportuna #955; e trasferisce la sua energia ad una molecola Q, che viene detta Quencer. L’energia è rilasciata da Q come radiazione luminosa di energia minore e quindi con una #955; più elevata o è dissipata come calore, in quest’ultimo caso si parla di dark quencer. L’efficienza di questo processo dipende dalla distanza esistente tra R e Q (distanza di Forster). Le condizioni indispensabili per realizzare il FRET Quencing sono:

-R e Q devono essere posizionati il più vicino possibile (10-100 Angstrom)
-Presenza di overlap tra lo spettro di assorbimento di Q e lo spettro di emissione di R, in modo da ottenere un ottimale effetto di quencing. È importante che gli spettri siano sovrapposti per non avere dissipazione di energia.

Quelle a cui ti riferisci sono le SONDE TAQMAN (o TAQMAN PROBES): sono oligo lineari di 25-28 pb marcate al 5’ con il REPORTER ed al 3’ con il QUENCER. Il quencer estingue la fluorescenza del reporter solo quando la sonda è integra; quando la sonda viene tagliata, il quencer ed il reporter si liberano in soluzione e si manifesta la fluorescenza. La liberazione del reporter avviene grazie all’azione della Taq polimerasi che è dotata di attività 5’-3’ esonucleasica. Una cosa importante da ricordare è che al 5’ della sonda non devono esserci G perché queste rafforzano l’azione del quencer. Inoltre, la Tm della sonda si aggira intorno a 68-70°C, quella dei primers intorno a 58-60°C. La fluorescenza si accumula ciclo dopo ciclo perché ad ogni ciclo aumenta la quantità di sonda tagliata.

Un Reverse ti permette di partire da RNA ed ottenere cDNA ke poi puoi utilizzare x la RealTime.

Spero di essere stata il + kiara possibile.

Farah
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 09 gennaio 2006 : 20:33:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Esistono anche altri metodi per fare real-time, come il SYBR Green, un intercalante che emette di piu quando e' intercalato nel DNA (un po' come l'EtBr).
Quindi piu DNA ds hai piu fluorescenza vedi.

Ovviamente il metodo Taqman e' molto piu sensibile e specifico, mentre il SYBR Green ti fa vedere tutto il DNAds.

Se fai una ricerca sul forum troverai altri topic che parlano di real-time, magari ti possono essere utili!

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mari11
Nuovo Arrivato

Prov.: Catania


14 Messaggi

Inserito il - 10 gennaio 2006 : 11:16:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mari11  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di mari11 Invia a mari11 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
tante grazie!!!
le vostre nozioni mi sono state di grande aiuto
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singleguy
Nuovo Arrivato

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Cesena


5 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2006 : 16:36:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di singleguy Invia a singleguy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Interessanti i vostri suggerimenti. Devo avvicinarmi per la prime volta a questa tecnica, abbandonando la classica PCR. Volevo chiedervi un aiuto. Dove posso trovare informazioni e spiegazioni sulla PCR real-time? Parto proprio dal principio, per cui vorrei conoscere anche le nozioni basi. Grazie

Gianfranco

gfrancopicone@libero.it

A presto, Già
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Er Mungo
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


4 Messaggi

Inserito il - 28 giugno 2007 : 12:43:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Er Mungo Invia a Er Mungo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
utilissimo 'sto forum....mi ha chiarito un dubbio...

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karme
Nuovo Arrivato

Prov.: Padova
Città: padova


2 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 17:07:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di karme Invia a karme un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti,
sapreste darmi delle dritte su come analizzare i dati ottenuti da una rt-cpr utilizzando il syber green?
grazie
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Cangrande
Utente Junior

Cangrande Della Scala

Prov.: Verona


280 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 21:52:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Cangrande Invia a Cangrande un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per informazione ci sono anche gli scorpion probes, i LUX e i molecular beacons.
Sono alternative valide e la loro applicazione dipende da ciò che si deve fare. BUONA REAL TIME A TUTTI!

Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala.
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crema2007
Nuovo Arrivato


Prov.: Prato
Città: Prato


15 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2008 : 15:17:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di crema2007  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di crema2007 Invia a crema2007 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno può spiegarmi come si fa la quantificazione relativa? Ho delle dispense a dir poco incasinate
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MaryngA
Nuovo Arrivato


Prov.: Parma
Città: Parma


29 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2008 : 18:13:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryngA Invia a MaryngA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma rt-pcr non vuol dire real time pcr ma bensì una retrotrascrizione da mRNA a cDNA seguita da una PCR. Questa pcr può essere sia una real time se ad es stiamo studiando l espressione di un gene sia una PCR classica che c serve x ottenere l inserto x un clonaggio!
Giusto?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2008 : 23:50:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da crema2007

Qualcuno può spiegarmi come si fa la quantificazione relativa? Ho delle dispense a dir poco incasinate


Cercando sul forum trovi qualcosa, ad es.:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=7440
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1423
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=7150

me ne ricordavo anche uno con una bella spiegazione con i calcoli ma non l'ho trovato!

Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA

Ma rt-pcr non vuol dire real time pcr ma bensì una retrotrascrizione da mRNA a cDNA seguita da una PCR. Questa pcr può essere sia una real time se ad es stiamo studiando l espressione di un gene sia una PCR classica che c serve x ottenere l inserto x un clonaggio!
Giusto?


Si è giusto... ma spesso "RT-PCR" viene usato anche per indicare la real-time e crea confusione!!!
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