Feed RSS: MolecularLab.itiCalendar file
Ricerca per similaritá e omologia

Come già osservato è possibile trovare degli errori nella computazione delle varie entry, trovandoci a volte in difficoltà sull'avere delle informazioni riguardo ad una sequenza. In questo caso é possibile eseguire la ricerca sulla base della similaritá di sequenza utilizzando programmi di “database searching” come FASTA o BLAST che confrontano una sequenza sonda con tutte le sequenze di una banca dati.

Ricerca mediante BLAST

BLAST è un motore di ricerca per sequenza nucleiche. Per usarlo abbiamo bisogno di avere la sequenza.. (che nella realtà ci viene da un sequenziamento o altri esperimenti).
Usiamo la sequenza proteica con ID: P13533.

  • Sempre dal sito della NCBI
  • Selezioniamo Protein e inseriamo l'ID della sequenza da cercare
  • Selezionando FASTA nel menú a tendina a destra del bottone “Display”  e premendo il bottone “Send to”, viene visualizzata la sequenza proteica.
    FASTA è un formato in cui la prima riga corrisponde al segno di maggiore seguito da un commento. Le righe successive corrispondono alla sequenza.
  • Copiamo la sequenza. [selezionamo il risultato in FASTA e premiamo CNTRL C, o clicchiamo con il dx > copia]
  • Ora dal sito www.ncbi.nlm.nih.gov selezioniamo BLAST

  • Come vedete si possono fare diversi BLAST, in funzione della sequenza che abbiamo noi e con che banca vogliamo confrontarla (quella di DNA, RNA, proteine?)
    Selezioniamo quindi "Standard protein-protein BLAST [blastp]", e nel campo Search inseriamo la sequenza presa prima, e clicchiamo su "BLAST".
    É anche possibile inserire direttamente l´ID invece della sequenza stessa, ma solo se si tratta di una sequenza presente nella banca dati.

  • Nella nuova finestra che si apre, vengono indicati i domini conservati nella sequenza fornita.
  • Premi il bottone “Format” per visualizzare il risultato dell´analisi BLAST.
  • Si osservano i risultati. I primi avranno uno score alto ed un E value tendente a zero. Lo score rappresenta quanto si possano appaiare, base per base le due sequenze, l'Evalue indica invece quanto è statisticamente probabile che l'allineamento sia casuale.
    Prendiamo nota degli ID per la sequenza corispondente in altre specie (seuqenza ortologa).
    Facciamo una tabella con ID nucleotidico, proteico e lunghezza della sequenza.
    Specie AC nt AC prot L (AA)
    Homo sapiens NM_002471.1
    NP_002462 1939
    Bos taurus      
    ..      
    ..      

Ricerca per omologia mediante FASTA

  • FASTA è il servizio analogo al BLAST, ma offerto d EMBL-EBI (il corrispondente europeo dell'NCBI).
    Per fare la nostra ricerca per omologia e similarità ci colleghiamo al sito www.ebi.ac.uk/fasta33/
  • Nella prima parte, possiamo indicare se cercare l'omologia tra banca proteica o acidi nucleici, se mandarci il risultato via e-mail o farlo direttamente sul sito, ed informazioni dettagliate sui parametri per effettuare l'omologia di sequenza.
    Inseriamo allora, la sequenza ottenuta prima (per riottenerla inserisci l'ID P13533 nel campo in alto a destra, indicando "Get Protein Sequence"), o direttamente l'ID. Notate che è possibile indicare un file di testo (non di Word), contenente la sequenza, ma che deve essere sempre nel formato Fasta.
  • L'attesa può essere più o meno lunga a seconda degli utenti che in quel momento stanno effettuando ricerche, ma una volta che il risultato compare, comparate i risultatati con i precedenti.
  • Dalla tabella presente all'inzio, selezionando "Mview" si osserva un multiallineamento tra le sequenze trovate.

 

Costruzione del profilo di  un multiallineamento di sequenze

  • Incolla in un file di testo, le sequenze trovate con il BLAST
  • Poi usiamo questo elenco per effettuare un multiallineamento trale varie sequenze. l'interfaccia web si trova al sito www.ebi.ac.uk/clustalw
  • inserisci nella apposita maschera le sequenze da allineare, o indica dove il file è presente (ma deve essere salvato) e lancia il programma.
  • Selezionando Jalview si apre una finestra java che da molte informazioni: mostra l'allinamento, ed è possibile editarlo manualmente, cambiare il colore, e mostrare un albero di distanza tra le diverse sequenze.



 
Disclaimer & Privacy Policy