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_pietro_
Nuovo Arrivato

Città: Lund


104 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2009 : 10:00:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _pietro_ Invia a _pietro_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, come mi sono gia' presentato, mi chiamo Pietro, sono dottorando al dipartimento di oftalmologia all'Universita' di Lund in Svezia. Arrivo al dunque:

Il dicembre scorso ho iniziato le mie esperienze di SDS-PAGE, Western blot e quant'altro. Tutto piuttosto dignitiso in partenza, ma man mano che acquisivo esperienza e conoscenza, lentamente i risultati andavano scemando, al punto che per un lungo periodo abbiamo rinunciato a fare esperimenti, solo per recuperare il setting giusto (che comunque non avevo cambiato). Vi risparmio questa parte, il risultato finale e' che avevo problemi alla fase del blotting (tra parentesi, uso un sistema semi-dry). Macchina? Buffer? Membrana? Chissa', fatto sta che abbiamo provato di tutto, e alla fine probabilmente un buffer dal pH troppo elevato e una blotting machine in decadimento hanno fatto i danni.

Ora ho recuperato un setting accettabile, ma alquanto strano e qui arrivano le mie domande:

1) Partendo da presupposto che e' consigliabile una corrente minima di 0,8 mA/cm2, io nella mia macchina ne uso esattamente il 60% (ed ho come la sensazione che sia ancora troppa). Perche'? La banda dell'housekeeping e' debole e il colore dello standard trapassa la membrana e arriva fino ai filtri (al terzo o quarto, mentre col precedente setting mi arrivavano anche all'ultimo filtro). Possibile o rischio di non riuscire a trasferirle? Pensavo anche di prolungare il blotting time, tanto la corrente e' talmente bassa che non scalda. Poi, il colore degli standard sono una buona approssimazione del trasferimento di proteine e della loro posizione, o corre per i fatti suoi?

2) Il mio precedente Blotting buffer era cosi' composto:
TRIS 48mM
Glicina 39 mM
SDS circa 0,4%

Ma il pH era troppo elevato: doveva essere 8,3 (senza bisogno di essere aggiustato, almeno cosi' mi dissero) mentre era 9,1. Cosi' ho cambiato e ho preso pari pari una ricetta dal sito della millipore: conteneva uguali quantita' di TRIS e Glicina, ma 0,04% di SDS e 20% di metanolo (che ho commutato in etanolo, pare sia meglio). La domanda 2 e': come un pH elevato come il mio influenzava il mio blotting? Qualcuno di voi ha esperienze di blotting utilizzando l'etanolo invece del metanolo?

Scusate la lungaggine, inutile dirvi quanto sia importante per me tutto cio'.

Rispondete numerosi

Pietro

Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2009 : 10:12:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non riesco a capire cosa significa che il colore dello standard trapassa la membrana e arriva ai filtri, cioè non so immaginarmi queta cosa, me la spiegheresti meglio?

per il blotting buffer, io uso queste concentrazioni:
Glicina 192 mM
Tris 25 mM
MetOH 20%

non ho MAI sentito di etanolo al posto di metanolo e come vedi nel buffer che ti ho indicato non c'è SDS.


...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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_pietro_
Nuovo Arrivato

Città: Lund


104 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2009 : 10:21:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _pietro_ Invia a _pietro_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,

i marker del peso molecolare hanno colori che ci servono per distinguere le diverse bande. Li possiamo vedere durante la corsa elettroforetica e in seguito al blotting li dovremmo vedere, approssimativamente tali e quali, sulla membrana (nitrocellulosa, PVDF che sia). Bene, io sostanzialmente dopo il blotting vedo solo tre bande delle 7 o 8 che dovrei. Ma sfogliando i filtri sottostanti, posso vederli tutti, segno evidente che, per lo meno i coloranti non hanno legato la membrana. E' senz'altro un problema di blotting, perche' i miei vicini di lab, che usano un sistema semi-dry, con membrane diverse (che ho provato) e buffer diverso, ha tutte le sue bandine colorate sulla membrana.

Etanolo? In effetti e' una cosa nuova. Mi e' stata consigliata perche', a quanto pare, funziona uguale al metanolo e non e' tossico. O quanto meno non in quelle dosi. Provalo... magari possiamo confrontarlo insieme (sia nel blotting buffer, sia nel pre-wetting)
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2009 : 12:55:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
perdonami, ma io non ho mai sentito che l'etanolo nel buffer possa sostituire il metanolo e sinceramnete, usando dei buffer già pronti comprati da biorad, in cui mi si dice di aggiungere metanolo, preferirei non cambiare (anche perchè funziona).

per la questione di marker...tu equilibri le membrane prima di fare il sandwich? premetto che io ho sempre usato la nitrocellulosa, ma so che anche quelle in pvdf vanno equilibrate con buffer di blotting per qualche minuto. seconda cosa, anche se non si trasferisce bene il marker (immagino che le bande che vedi si riferiscano agli alti PM), hai poi provato a blottare per la tua proteina? quella la vedi almeno?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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_pietro_
Nuovo Arrivato

Città: Lund


104 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2009 : 14:14:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _pietro_ Invia a _pietro_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, se le cose funzionano non cambiare, hai ragione... uso membrane in PVDF millipore 0.45

1) Si', prima etanolo (o metanolo), poi MilliQ Water, finche' non risulta totalmente idrofilica e per finire in Blotting buffer.

2) Vedo piuttosto chiaramente i pesi molecolari che vanno da 95 KDa a 55, gli altri sono molto tenui. Tra l'altro uso il Page Ruler della Fermentas, se ti puo' essere utile. La mia proteina? Sono ancora a livello di Housekeeping (beta-actina nel mio caso). Il segnale che mesi fa mi dava era deciso. Ora c'e', l'ho recuperato, ma e' meno della meta' di intensita'. Ad ogni modo, ora sto blottando, se mi esce l'actina provero' a strippare e provare un altro anticorpo per una proteina di diverso peso molecolare, poi vedremo.
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2009 : 21:00:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora... quante cose tutte insieme PROVO ad inserirmi anche io senza fare confusione.

1) Io non uso il semi-dry, maso ke chi lo usa (persone di cui mi fido) usano l'SDS nel blotting buffer. Quindi questo non mi stupisce. D'altra parte non ho mai sentito della ssostituzione del metanolo cn etanolo! Mi è nuova!

2) io uso sia nitrocellulosa che PVDF e il PVDF lo attivo rigorosamente tenendolo 20 secondi in metanolo 100%, poi un paio di minuti in acqua e poi qualche minuto nel blotting buffer.

Scusate ma ora devo scappare... ma ne avrei altre da dire

A presto

Ascoltami con gli occhi...
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2009 : 21:12:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
_pietro_ una cosa importantissima a MIO MODESTISSIMO avviso!

Se già il tuo trasferimento non è ottimale, e quindi i segnali ne risentono, non stripperei il filtro per andarci a vedere una seconda proteina! Lo stripping infatti indebolisce inevitabilmente tutti i segnali ke andrai a rilevare dopo.

Buona fortuna.

Ascoltami con gli occhi...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2009 : 22:10:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Leggo ora questa interessante discussione.
Innanzitutto volevo far presente che non è poi così strano utilizzare Etanolo al posto di Metanolo, molti lo fanno appunto perchè è meno tossico. Sinceramente non saprei dire se l'efficienza sia la stessa rispetto al metanolo perchè personalmente non ho mai provato, ho cercato qualche referenza ma l'unica che ho trovato riguarda l'utilizzo di "isopropanolo", che non avevo mai sentito come alternativa, comunque se vi interessa il paper è questo:
Electrotransfer of proteins in an environmentally friendly methanol-free transfer buffer.

Poi riguardo ai problemi di trasferimento di _pietro_ ho qualche domanda, innanzitutto tu dici:
Citazione:
Vedo piuttosto chiaramente i pesi molecolari che vanno da 95 KDa a 55, gli altri sono molto tenui.

siccome 95 e 55 stanno nel mezzo quali ti perdi e vedi sui filtri sottostanti? Quelli a PM maggiore o minore?
Poi è veramente strana come cosa, il PVDF dovrebbe trattenere le proteine e non farle trapassare oltre la membrana (cosa in genere più facile con la nitrocellulosa) io ho sentito spesso di problemi di proteine che rimangono sul gel, ma sinceramente mai di proteine che trapassano la membrana.
Inoltre dici anche:

Citazione:
E' senz'altro un problema di blotting, perche' i miei vicini di lab, che usano un sistema semi-dry, con membrane diverse (che ho provato) e buffer diverso, ha tutte le sue bandine colorate sulla membrana.

non ho capito se hai provato tutto il loro sistema completo o se hai provato le membrane loro col tuo sistema, se non l'hai fatto io farei questa prova. E' solo una sensazione, ma mi viene il dubbio che ci sia qualcosa che non va nelle tue membrane.

I miei ricordi di Semi-Dry blotting risalgono a moooooolto tempo fa, ma ricordo che usavamo buffer diversi per anodo e catodo, assolutamente non ricordo però le ricette e non ho modo di recuperarle. (ovviamente su internet ne trovi una marea)
Cercando un po' ho trovato questo che forse può esserti utile: http://www.bio.net/bionet/mm/methods/1993-May/005560.html

Magari questo lo sapete già ma riporto linko qua quello che ho scritto in altre discussioni riguardo all'utilizzo di SDS e metanolo:
nel transfer buffer:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=6747#56656
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3828#56508

Beh _pietro_ visto che è passato un po' di tempo, facci sapere se hai risolto e se ci sono novità!

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_pietro_
Nuovo Arrivato

Città: Lund


104 Messaggi

Inserito il - 26 ottobre 2009 : 16:23:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _pietro_ Invia a _pietro_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti, dopo 20 giorni e 2 risposte e' arrivato il momento di aggiornarvi:

ho insospettabilmente risolto i miei problemi (in modo fortunoso? boh, questa e' la scienza del resto). I miei problemi stavano proprio li': blotting buffer da pH troppo elevato (e qui mi piacerebbe sapere da qualcuno quali ne sarebbero le conseguenze), la blotting machine che mi era andata in apoptosi, ma alla fine, il problema delle bande degli standard l'ho risolta (?) con una nuova membrana, coi pori di 0,2 micro. Non sono perfettamente sicuro che con questa membrana le mie proteine siano tutte dentro, ma mi sembra una buona approssimazione. In sostanza, riesco a lavorare, seppur con un setting alquanto dubbio. Vedro' in futuro di fare altri tentativi, ma per il momento va bene cosi'.

Ora, rispondendo a voi:

Gst _ Lo stripping era solo un tentativo di vedere qualcosa in piu', o meglio, di diverso. Mi rendo conto delle sue controindicazioni.

GFPina _ Gli standard li vedevo tutti quanti nei filtri sottostanti, poi magari alcuni, vuoi per la quantita' intrinseca, vuoi per il setting che si adatta al trasferimento di alcuni pesi molecolari invece di altri, rimanevano anche sulla membrana. Ora con la nuova membrana coi pori piu' piccoli vedo gli standard solo sulla membrana e un pochino di quelli ad alto peso molecolare rimangono sul gel, ma davvero poco. Rimangono ancora alcuni punti oscuri, ma finche' le cose vanno le lascio andare. Perdona il tuo nemico, ma non scordarti mai il suo nome. E' quello che faro'.
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2009 : 18:05:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma scusa perche non usi il transfer ad immersione????
la membrana da 0,2(per quel che ne so io)
va bene per proteine molto piccole. se quelle che cerchi hanno peso piccolo ok altrimenti sono cavoli.
cmq io ti consiglio di leggerti il manuale wb che trovi sul sito abcam è chiarissimo. e parla di semy-dry e non mettendoli a confronto.
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_pietro_
Nuovo Arrivato

Città: Lund


104 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2009 : 13:50:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _pietro_ Invia a _pietro_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non uso un transfer ad immersione perche' evidentemente abbiamo un setting che non lo prevede.

La membrana da 0.2? Bel mistero, quello che hai detto e' teoricamente corretto, poi se consideri che ho blottato in maniera eccellente una proteina da 195 KDa (non propriamente una piuma).

Guarda, ho letto protocolli di ogni tipo, Abcam, Millipore, R&D, libri... tante buone indicazioni, ma nulla di univoco. Loro ti sconsigliano una cosa e poi la provi tu e funziona bene. E succede spesso.. mmah

Grazie comunque del contributo, apprezzo
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