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luckybio
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 05 ottobre 2010 : 11:51:02
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Ciao a tutti.Qualcuno mi saprebbe spiegare la tecnica del far western,
non il protocollo ma qual è il principio con cui funziona.
Grazie in anticipo
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 12:56:58
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hai presente il western blotting? In quel caso trasferisci un insieme di proteine separate per sds-page su un foglio di nitrocellulosa ed usi un anticorpo specifico per la proteina che ti interessa, in modo da poterla rivelare. Nel caso del far western blotting, invece di usare un anticorpo usi un'altra proteina (detta probe) che può legare una o + delle proteine trasferite. In questo modo identifichi i binding partner della tua proteina probe. poi per rivelare l'interazione usi i metodi classici: anticorpi contro la proteina probe etc.
Sinceramente non credo che con questo metodo tu sia in grado di rilevare tutte le potenziali interazioni, in quanto la sds page denatura le proteine (e molte interazioni richiedono che i domini proteici conservino il loro folding). |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 13:25:43
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Sinceramente non credo che con questo metodo tu sia in grado di rilevare tutte le potenziali interazioni, in quanto la sds page denatura le proteine (e molte interazioni richiedono che i domini proteici conservino il loro folding).
Ciao, mi inserisco nella discussione visto che potrebbe essere qualcosa che posso usare nel mio lavoroe che avevo sentito solo di nome in effetti.
Stai dicendo che potrebbe avere una certa valenza se associata ad un gel/trattamenti non denaturanti? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 14:49:53
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| Beh non so dirti se all'atto pratico può essere associata a una elettroforesi in condizioni native. In effetti mi sembra più logico. Però non ho esperienza con la tecnica, ne conosco solo il principio e quella che ho postato sopra è solo una mia ipotesi. Dovresti chiedere a qualcuno che l'ha usata e la conosce bene. |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 16:21:29
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ESPERTI QUI?!?!!?  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 12:52:33
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| Quindi a quanto ho capito, nella migliore delle ipotesi otterro' delle bande che saranno le proteine che interagiscono col peptide/proteina probe, ma non sapro' nulla a proposito di queste proteine, se non il peso molecolare. Insomma, un indicazione ma non certo la certezza. Sbaglio? |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 14:53:35
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| non avevo mai sentito questa tecnica! FAR WESTERN?!.. ahah.. c'è da aprire una discussione SOLO per parlare della scelta dei nomi delle tecniche... Se il primo non si fosse chiamato SOUTH eh?? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 17:26:26
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Citazione:
Messaggio inserito da _pietro_
Quindi a quanto ho capito, nella migliore delle ipotesi otterro' delle bande che saranno le proteine che interagiscono col peptide/proteina probe, ma non sapro' nulla a proposito di queste proteine, se non il peso molecolare. Insomma, un indicazione ma non certo la certezza. Sbaglio?
Beh immagino che puoi scegliere ab origo di restringere il campo di ricerca su target potenziali della tua proteina/probe (che ne so, proteine che hanno domini noti per interagire con la tua probe). In questo modo hai una cerchia + stretta.
Se invece giustamente preferisci usare un estratto di proteine TOTALI, ci sono diverse tecniche che ti consentono di risalire all'identità dei binding partner: dal sequenziamento di edman alla spettromnetria di massa (generalmente con la spettrometria di massa si esegue prima una bidimensionale però). |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2010 : 09:28:50
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Beh immagino che puoi scegliere ab origo di restringere il campo di ricerca su target potenziali della tua proteina/probe (che ne so, proteine che hanno domini noti per interagire con la tua probe). In questo modo hai una cerchia + stretta.
Se invece giustamente preferisci usare un estratto di proteine TOTALI, ci sono diverse tecniche che ti consentono di risalire all'identità dei binding partner: dal sequenziamento di edman alla spettromnetria di massa (generalmente con la spettrometria di massa si esegue prima una bidimensionale però).
Ricapitolando, un esperimento ideale in questo contesto potrebbe essere una immunoprecipitazione per la proteina "probe" (per restringere la cerchia delle interazioni), una corsa elettroforetica in condizioni native (o una bidimensionale), seguita da Far Western e, in caso di buona riuscita, una spettrometria di massa per l'individuazione definitiva dei partner della proteina probe. Il che mi sarebbe interessantissimo, visto che potrei avere accesso o contatti per usare tutte queste facilities.
Figo! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2010 : 09:58:58
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| beh io personalmente opterei più per un approccio olistico: immunoprecipitazione della mia proteina e analisi dei complessi proteici legati ad essa tramite bidimensionale seguita da spettrometria di massa. L'ho già fatto per alcune proteine (vabbè capirai ho precipitato la proteina e poi il resto l'ho dato a una facility di MS) e direi che funziona. |
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far western
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