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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 27 settembre 2006 : 23:11:51
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Utilizzate la tecnica della colorazione del gel con Coomassie per visualizzare le proteine dopo la loro separazione nel gel?
Quali sono i vari passaggi che seguite?
Che soluzioni impiegate?
Grazie, vorrei un vostro parere.
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 23:27:52
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io faccio così, ma mi pare ke ognuno vari leggermente:
Protein SDS stain
Per 500 ml:
- pesare 0.25 g Coomassie Blue R-250 e sciogliere in 230 ml di etanolo
- pesare 0.25 g CuSO4 e sciogliere in 220 ml di H2O
- unire le due soluzioni ed aggiungere 50 ml di acido acetico glaciale
DESTAIN
10% Acido Acetico, 10% Etanolo
Lasciare colorare il gel in blanda agitazione per almeno un’ora.
Decolorare con 10% etanolo + 10% acido acetico in leggera agitazione con cambi della soluzione decolorante fino alla scomparsa del colore di fondo.
Conservare in acqua oppure seccare.
se non è nei protocolli l'aggiungo.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 00:15:47
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| Io infatti ho delle soluzioni leggermente diverse e prima della colorazione fisso le proteine su gel con una soluzione di acido acetico e metanolo... ma a memoria non ricordo esattamente le concentrazioni, dovrei controllare! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 00:34:35
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noi abbiamo deciso di rimuovere il metanolo ovunque sia possibile...
ora ci stiamo battendo per l'etidio!
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 12:22:30
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Anche io ho delle soluzioni diverse da quelle proposte e purtroppo da noi non si riesce a far capire ai boss che il metanolo è meglio evitarlo...
Per lo meno faciamo sempre tutto sotto cappa.
Se ti interessa la mia procedura e le ricette sono le seguenti:
Colorante
Comassie Brillant Blue R250 0.5 g
Metanolo 100 ml
Il colorante va sciolto in metanolo.
Poi va aggiunto l'acido acetica e l'acqua
Acido Acetico 40 ml
H2O 60 ml
La colorante va fatta in vetro possibilmente scuro oppure ricoperta con un foglio di alluminio.
DECOLORANTE
H2O 1.4 l
Acido Acetico 0.2 l
Metanolo 0.4 l
Tenco i8l gel 20 - 30 minuti in colorante.
Poi rimuovo la colorante e sciacquo con qualche ml di decolorante.
Aggiungo poi ca 30 - 40 ml di decolorante per gel e lacio in agitazione sulla basculante per ca 1 - 2 h.
Per migliorare la decolorazione aggiungo nella vaschetta un po' di carta assorbente (quella dei rotoli per asciugarsi le mani); il colorante si lega alla cellulosa
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Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 12:22:39
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Hai ragione Alexo, anche noi abbiamo eliminato il metanolo!!!
la metodica è questa:
COLORAZIONE DEL GEL CON BLUE COMASSIE
- Immergere il gel nella FIXING SOLUTION (40% Etanolo-10% Acido Acetico) per 30min
- Immergere il gel nel BLUE COMASSIE (0.29gr Blue Comassie in 25% Etanolo 8% Acido Acetico ) e lasciarlo a colorare per 10min.
- Sciacquare con dH2O per eliminare l’eccesso di colorante
- Decolorare il gel con la DESTAINING SOLUTION (25% Etanolo - 8% Acido Acetico), cambiare una volta e lasciar decolorare per una notte
- Sciacquare il gel con dH2O e avvolgerlo in un foglietto protettivo per conservarlo
Per quanto riguarda l'etidio io sto iniziando ad usare il Syber Green al suo posto, anche se in realtà non dimostrato che sia meno tossico!!!  |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 16:48:19
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Grazie ragazzi!!!!
Ora ho l'imbarazzo della scelta, devo solo convincere i miei capi.
Se potete, cercate di aggiungere i protocolli nell'apposita sezione, grazie ancora!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 18:02:30
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Citazione:
Se potete, cercate di aggiungere i protocolli nell'apposita sezione, grazie ancora!!!
Fatto (più o meno, spero sia a posto, ma devo finire di sistemare i reagenti)
Però mi sono accorta di un erorre sulla quantità di Blue comassie:
0.29gr sono per una soluzione di 250ml
sono quindi 0.116gr per 100ml (ma nel protocollo inserito è giusto!!) |
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
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Caspase
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2006 : 20:36:07
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Questa è la metodica che usiamo noi in lab. Va bene e colora che è una meraviglia. Personalmente non ho mai decolorato un comassie come avete detto voi. Quello che ho fatto è lava lava lava in acqua deionizzata e poi sopra ho fatto un Silver Vourom.
Comassie Colloidale
Dopo la corsa elettroforetica il gel viene lavato in H2O bidistillata
Il gel viene fissato in una soluzione 40% metanolo, 10% Acido acetico per 1 ora
Il gel fissato viene immerso in una soluzione composta da 40ml metanolo e 160ml soluzione madre di comassie (volume finale: 200ml)
Il gel può rimanere in questa soluzione di colorazione da alcune ore ad alcuni giorni.
Dopo che si lava con acqua per togliere l'eccesso di colorante.
Soluzione madre (volume finale 500ml)
Comassie G-250 150% 0.75g (Applichem)
Acido Fosforico 2% 10 ml
Ammonio Solfato 10% 50 g
H2O distillata a 500 ml
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Fèmm
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 15:19:54
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Ciao. Ho una richiesta per GFPina e Alexo: Immagino che qualcuno abbia pubblicato un articolo sulla sostituzione del metanolo con l'etanolo nei protocolli per stain e destain, avete mica gli articoli? non riesco a trovarli.
In compenso ho trovato questo relativo alla sostituzione del metanolo con isopropanolo nel transfer buffer per il western e vi suggerisco di prenderlo in considerazione.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17850757
Non l'ho ancora provato, ma sono intenzionata.
Ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 15:53:25
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Ciao Fèmm,
benvenuta su MolecularLab!
Grazie per l'articolo che hai linkato, lo conosco molto bene e l'ho già segnalato in precedenza, ma vorrei farti notare che questa è una discussione di quasi 4 anni fa in non si parlava di buffer di trasferimento ma di colorazione con Coomassie.
Se sei interessato a questo discorso ti consiglio queste 2 discussioni (dove appunto è segnalato quell'articolo):
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=15016
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=6747
Riguardo ad articoli sulla sostituzione del metanolo nella colorazione con Coomassie, io personalmente non ne ho e non mi ricordo se ne avessi mai indicato qualcuno. Ma personalmente non mi interessa molto perchè ultimammente sono passata al BioSafe Cooassie, che oltre ad essere meno tossico è anche notevolmente più comodo.
Comunque facendo una ricerca in Pubmed per "Coomassie" e "ethanol" dovresti trovarli. Trovi anche protocolli in cui hanno eliminato del tutto qualsiasi alcool e acido acetico, tipo questo:
Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid.
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Discussione |
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Coomassie
Didattica
