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biotech89
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 03 marzo 2017 : 17:26:21
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Ciao!
Ho letto le discussioni sul "passare le cellule" e avrei un paio di dubbi, spero possiate aiutarmi a capire meglio questa tecnica.
Faccio un esempio.
Ho una fiasca a confluenza e voglio passare le cellule in un'altra fiasca con diluizione 1:4. Quello che faccio nel mio lab è di eliminare il terreno, fare un lavaggio con PBS, aggiungere 0,5 ml di tripsina e poi 3,5 ml di terreno nuovo. Ho quindi 4 ml totali e prelevo 1 ml che metto nella nuova fiasca, a cui ho precedentemente aggiunto 3 ml di terreno nuovo.
Io sono una tirocinante e faccio come mi viene detto. Però mi chiedo:
- non facendo una centrifugata, la tripsina che rimane così insieme alle cellule nella nuova fiasca, non rischia di rovinare le cellule?
- aggiungendo 1 ml di cellule nella nuova fiasca contenente altri ml di cellule, non le sto diluendo ulteriormente?
Grazie a chi risponderà.
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2017 : 17:38:36
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Ciao!
Hai pensato perché lavi con PBS prima di aggiungere la tripsina? Perché il medium inibisce la tripsina, quindi con il PBS lo lavi via. Se diluisci la tripsina 1:4-5 con medium puoi evitare di lavare perché viene sostanzialmente completamente inattivata; nel tuo caso la stai diluendo 1:32, quindi puoi stare più che tranquilla che la tripsina è bella che andata alla fine.
Riguardo la tua seconda domanda: sì, certo, le diluisci (credo nel testo intendessi "altri ml di medium" e non di cellule, giusto?), ma hai comunque un numero totale di cellule che è 1/4 di quelle nella fiasca originale, che è il tuo obiettivo. In ogni caso non puoi seminare in una fiasca meno di 4-5 ml di medium perché non coprirebbe il fondo.
A disposizione per ulteriori chiarimenti!
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6940 Messaggi |
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biotech89
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2017 : 17:52:11
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Citazione:
Messaggio inserito da Caffey
Ciao!
Hai pensato perché lavi con PBS prima di aggiungere la tripsina? Perché il medium inibisce la tripsina, quindi con il PBS lo lavi via. Se diluisci la tripsina 1:4-5 con medium puoi evitare di lavare perché viene sostanzialmente completamente inattivata; nel tuo caso la stai diluendo 1:32, quindi puoi stare più che tranquilla che la tripsina è bella che andata alla fine.
Riguardo la tua seconda domanda: sì, certo, le diluisci (credo nel testo intendessi "altri ml di medium" e non di cellule, giusto?), ma hai comunque un numero totale di cellule che è 1/4 di quelle nella fiasca originale, che è il tuo obiettivo. In ogni caso non puoi seminare in una fiasca meno di 4-5 ml di medium perché non coprirebbe il fondo.
A disposizione per ulteriori chiarimenti!
scusami non ho capito con quale calcolo sei arrivato a parlare di diluizione 1:32. |
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2017 : 18:15:22
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Prima diluisci 0,5 ml di tripsina + 3,5 ml di terreno (1:8), poi ne prendi 1 ml e lo aggiungi a 3 ml di terreno (1:4). 1:8 x 1:4 = 1:32
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biotech89
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2017 : 22:49:00
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| ok grazie mille ad entrambi! :) |
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