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Bernardi
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Inserito il - 09 maggio 2007 : 15:35:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao gente qualcuno sa come posso fare a titolare dei virus on emoagglutinanti ottenuti da colture su cellule in monostrto?
grazi anticipatamente

Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6922 Messaggi

Inserito il - 09 maggio 2007 : 21:27:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
virus NON emoagglutinanti?

Puoi farlo per CPE50 o per placche.

Ti servono le procedure in linea di massima? Ti servono i protocolli completi? Che virus sono?

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Bernardi
Nuovo Arrivato

Prov.: Siena
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14 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2007 : 18:23:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
suppongo che CPE50 sia un altro modoper definire TCID50, comunque si! mi servirebbe tutta la teoria e la pratica che mi puoi fornire!
effettivamente ho lasciato una N a casa (non emoagglutinanti)
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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6922 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2007 : 22:23:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora... spiegare la CPE50 non è semplice, soprattutto su un forum, è più facile a farla che a spiegarla, in effetti. Intanto la sigla, non ricordo esattamente l'acronimo ma in pratica misura a che concentrazione un virus causa il 50% di effetto citopatico sul monostrato.

Si parte piastrando le cellule in piastre da 96 (8x12), quando sono a confluenza (non totale) si infetta. L'infezione va fatta con varie diluizioni di virus: diluizioni seriali che arrivano fin dove ti serve (io arrivavo fino a 10^-8, ma per virus particolarmente concentrati va bene anche andare oltre).

Ogni colonna da 8 pozzetti va infettata con il virus. In quei pozzetti ci va fino a 100 microl, quindi per star sicuri si devono preparare almeno 1.8 o 2 ml di virus per ogni diluizione (diluizione che va fatta nel terreno di coltura), perché la cosa va fatta in doppio.

Per non rischiare di inquinare il pozzetto successivo, cambia punta ad ogni diluizione, e di rigore prima di infettare TUTTI e 96 i pozzetti andrebbero lavati con terreno senza siero, ma solo i folli lo fannno, a me è sempre andata bene ugualmente. Si dividono le colonne da 8 pozzetti in due gruppi da 6 colonne (tipicamente che vanno da 10^-3 a 10^-8), in modo da avere appunto i doppi, dividendosi la piastra in due. Come puoi capire, per ogni punto dell'esperimento va usata una piastra completa (ad esempio, se hai 4 tempi devi piastrare e infettare 4 piastre). I risultati si leggono dopo 36-48h

Come si leggono i risultati? Eh, questa è la cosa più difficile da spiegare, in pratica ci vogliono dieci minuti, ma è da capire. Allora: ogni colonna avrà una certa quantità di pozzetti con effetto citopatico, tipicamente a 10^-3 l'avranno tutti, a 10^-8 pochi o nessuno. Se trovi una concentrazione virale a cui tutti e due i duplicati risultano 4 pozzetti su 8 sei davvero fortunato, e il tuo lavoro è finito: il titolo della CPE50 è quella concentrazione, cambiando di segno all'esponente (se la trovi a 10^-6 il titolo è 10^6). Altrimenti devi calcolartelo.

segnati su un pezzo di carta due colonne: una per la diluizione (10^-3, 10^-4...) e uno per i pozzetti trovati con effetto citopatico, ad esempio:

10^-3 || 8/8
10^-4 || 8/8
10^-5 || 6/8
10^-6 || 3/8
10^-7 || 1/8
10^-8 || 0/8

Fatto questo fai altre due colonne, una che mostra quanti pozzetti hanno effetto citopatico e una che mostra l'opposto, cioè quanti pozzetti non mostrano effetto citopatico. Nel nostro esempio:

+ || -
8 || 0
8 || 0
6 || 2
3 || 5
1 || 7
0 || 8

Se sei riuscito a seguirmi fino a qui complimenti (mi sa che questa cosa la posto anche nei protocolli...)!

Ora bisogna fare delle somme. Per fare queste somme rifacciamo le famose colonne: una che mostra le diluizioni, partendo dal basso all'alto, l'altra che fa la somma dei negativi; inoltre aggiungiamo altre due colonne, una che mostra le diluizioni, partendo stavolta dall'alto al basso e una la somma dei negativi. Seguendo l'esempio:


Dil || Som + |||| Dil || Som -
10^-8 || 0 |||| 10^-3 || 0
10^-7 || 1 |||| 10^-4 || 0
10^-6 || 4 (1+3) |||| 10^-5 || 2
10^-5 || 10 (4+6) |||| 10^-6 || 7 (2+5)
10^-4 || 18 (10+8) |||| 10^-7 || 14 (7+7)
10^-3 || 26 (18+8) |||| 10^-8 || 22 (14+8)

Si scrivono così perché in effetti si sommano le prime dal basso, e le seconde dall'alto.

A questo punto possiamo renderci conto delle percentuali di effetto citopatico. Ancora tre colonne: la prima con le diluizioni, la seconda con il rapporto positivi/osservati, la terza con la percentuale. Il rapporto si ha confrontando i risultati ottenuti sopra, alla minima diluizione ho 26 pozzetti con effetto citopatico e 0 senza, quindi ho 26/26, alla terza, ad esempio (10^-5) ho 10 pozzetti con effetto citopatico e 2 senza, per un totale di 12 pozzetti osservati, quindi 10/12. Seguendo l'esempio:

Dil || Pos/Oss || %
10^-3 || 26/26 || 100%
10^-4 || 18/18 || 100%
10^-5 || 10/12 || 83.3%
10^-6 || 4/11 || 36.4%
10^-7 || 1/15 || 6.7%
10^-8 || 0/22 || 0%

A questo punto c'è una formula: (percentuale > di 50% -50)/(percentuale > di 50% -percentuale < 50%), nel nostro esempio (83.3-50)/(83.3-36.4)=0.71

Questo 0.71 lo sommiamo a 5, in quanto 5 è l'esponente della diluizione che ha dato il risultato immediatamente superiore al 50%, quindi abbiamo 5.71, questo numero lo usiamo come esponente di 10, quindi verrà 10^5.71, che equivale a 5.12x10^5 e quello è il nostro titolo espresso in PFU (Plaque Forming Unit).

Ora scusami, ma credo che la titolazione per placche la scriverò domani, anche se praticamente qualunque virus può essere titolato per CPE50. Non so come verrà formattato il testo, ho cercato di mettere tutto in colonna con delle righe verticali, spero servano, o al massimo spero siano utili le didascalie messe sopra.

Dimenticavo! La titolazione l'hai fatta in doppio, quindi questi conti li devi fare anche per il doppio, poi si fa la media dei risultati.

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Bernardi
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Inserito il - 11 maggio 2007 : 10:35:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'acronimo l'hai risolto da solo è ovvero l'effetto citopatico nel 50% della coltura, ma questa determinazione è occhiometrica, non è troppo soggettiva? e poi molte volte l'effetto citopatico non è evidente per i virus e penso che l'influenza sia fra questi, mi pare anche gli adenovirus, il morbillo e molti altri, ma correggimi
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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6922 Messaggi

Inserito il - 11 maggio 2007 : 16:23:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
morbillo e influenza si titolano tranquillamente per emoagglutinazione, essendo ortho e paramyxovirus, adeno non ho esperienza. Sì, è occhiometrica, ma probabilmente è più precisa dell'emoag. e conta i virioni, non le HAU (che sono centinaia di migliaia di virioni).

L'effetto citopatico in effetti non è sempre semplicissimo da determinare, ma in quei casi si rilegge il giorno dopo e, se si hanno dei dubbi se un pozzetto ha o meno effetto citopatico, di certo con un po' più di tempo si capisce: o è andato avanti e allora si vede bene, o non si è mosso e allora semplicemente si son rovinate le cellule per motivi indipendenti dal virus

Poi ovviamente l'effetto citopatico dipende dal virus: VSV distrugge la coltura, Sendai virus fonde le cellule... nuclei ingrossati, cambio di morfologia o di adesione... ce ne sono di cose da guardare!

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Bernardi
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Inserito il - 15 maggio 2007 : 10:31:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
accidenti Giuliano te ne ho fatto perdere di tempo...!
Ma ti devo sottoporre un'altra domanda: sai se ci sono metodi più precisi (non occhiometrici) o kit per la titolazione virale?
grazie ancora
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Giuliano652
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Prov.: Brescia


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Inserito il - 15 maggio 2007 : 15:31:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'unico metodo che mi viene in mente è per placche (scusami, non ho avuto il tempo di postarlo, prossimamente, promesso), si fa senza l'ausilio del microscopio, guardi dove è danneggiato il monostrato, conti le placche (i punti di danneggiamento) e da lì ricavi il titolo. Kit per la titolazione non ne conosco, non conosco nemmeno strumenti adatti, credo che si titoli in tutto il mondo in questi tre modi (o anche per emoadsorbimento, ma per quello ci vuole un virus emagglutinante)

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Bernardi
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Inserito il - 15 maggio 2007 : 17:04:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
secondo te una titolazione per Q-PCR è fattibile?
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Giuliano652
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Prov.: Brescia


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Inserito il - 15 maggio 2007 : 17:36:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non lo so, non credo però: la titolazione serve per avere una quantificazione del virus infettante, sapere la quantità di DNA o di RNA potrebbe non essere così immediato nel trasformarlo nella quantità di virioni.

Una piccola curiosità: perché non va bene la CPE50? Insomma, ti da risultati dell'ordine di 10^5-10^6 o anche maggiori, non credo che ti serva una grande precisione. Le infezioni si fanno sempre per PFU/cell, essendo le cellule un numero compreso tra 100.000 e 1.000.000 in genere al momento delle infezioni, basta sapere quanti microl di virus vanno presi per avere quelle PFU/cell, e se scappa che ci sono quattro o cinque virioni in meno... sticavoli!

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Bernardi
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Inserito il - 16 maggio 2007 : 09:54:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il fatto è questo: se è una mavìcchina a dire che c'è il virus sono tutti daccordo se sono io sola soletta che magari il giorno prima ho dormito poco bene non va più bene!
Io purtroppo parlo di controllo di qualità e non di ricerca ho bisogno di numeri reali, è molto diverso dall'università!
grazie Giuliano
buon lavoro
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Giuliano652
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Prov.: Brescia


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Inserito il - 16 maggio 2007 : 10:37:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
capito. Allora la domanda è un'altra: perché va bene l'emoagglutinazione, visto che è enormemente meno precisa?

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Inserito il - 16 maggio 2007 : 13:02:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
infatti non va bene l'emoagglutinazione, anche se secondo l'EMEA è ok, io però per complicarmi meno la vita volevo qualcosa di rilevabile con uno strumento. Penso che sia umano puntare alla sopravvivenza
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Giuliano652
Moderatore

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Inserito il - 16 maggio 2007 : 13:36:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
hai ragione. Purtroppo non ti so aiutare più di così.

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Bernardi
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Inserito il - 29 maggio 2007 : 17:03:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
X Giuliano
Ciao senti una cosa oggi mi hanno detto che in molte aziende fanno il TCID50 tramite saggio delle luciferasi, ti risulta qualcosa? dovrei praticamente inserire un plasmide con la luciferasi e un reporter all'interno delle cellule, selezionarle per un reporter poi infettarle con diluizioni del mio virus a titolo incognito, dopo di che prendere il sovranatante metterci a contatto il substrato delle luciferasi e valutare a luminometro l'intensità del segnale.
Ti risulta che faccia così perchè io sto ipotizzando molto
Grazie
Giulia
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Giuliano652
Moderatore

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Inserito il - 30 maggio 2007 : 00:22:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non conosco questa procedura, così ho cercato qualcosa online. L'unico articolo che finora ho trovato parla di HIV, SIV e compagnia bella, dice che quantificano la neutralizzazione del virus tramite la luciferasi (luciferasi ingegnerizzata nelle cellule, sotto il controllo della proteina Tat virale), ma la titolazione la fanno tramite TCID50 (cioè la mia CPE50), poi, sapendo quanto virus hanno usato per ogni punto, usano gli anticorpi e verificano la neutralizzazione con la luciferasi. Non l'ho letto tutto causa orario (e sonno conseguente), quindi ti lascio il link, magari ho capito male io e invece ti è utile.

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moonycinzia
Utente Junior



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Inserito il - 30 maggio 2007 : 06:06:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di moonycinzia Invia a moonycinzia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Messaggio inserito da Giuliano652

Allora... spiegare la CPE50 non è semplice, soprattutto su un forum, è più facile a farla che a spiegarla, in effetti. Intanto la sigla, non ricordo esattamente l'acronimo ma in pratica misura a che concentrazione un virus causa il 50% di effetto citopatico sul monostrato.[quote]
Fico!
Voglio farlo anche io!uffi ma perchè mi sono data alla biochimica?
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Giuliano652
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Inserito il - 30 maggio 2007 : 09:54:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cinziè... so scelte!

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Bernardi
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Inserito il - 30 maggio 2007 : 12:34:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bernardi Invia a Bernardi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie Giuiano!
in effetti Cinzia la biochimica è una bella palla!!!
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