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vania
Nuovo Arrivato

Prov.: Milano
Città: milano


29 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2007 : 15:46:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di vania Invia a vania un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Si parla sempre di topi knock out,ma mai di topi knock in.
Nell'esame precedente ho studiato animali trasgenici ottenuti per transgenesi standard(risultato:acqisto di una nuova funzione genica) e animali knock out ottenuti per gene targeting(dove si ha perdita di funzione genica mediante inattivazione genica mirata per ricombinazione omologa).
Nell'easme che sto studiando ora ci sono i topi knock in e non riesco a capire come lo genero e che variazioni ci sono nell'espressione genica.
Vi prego aiutatemi a capire!

vania

Giuliano652
Moderatore

profilo

Prov.: Brescia


6911 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2007 : 15:52:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Uhm... non sono sicuro ma credo che siano topi in cui un gene espresso sotto il controllo di un particolare stimolo sia stato reso costitutivo, quindi espresso costantemente (che è il contrario dei knock out, cioè con un gene silenziato)

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2007 : 20:57:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Semplicemente il knock-in è il contrario del knock-out, un gene anziché essere silenziato (knock-out) viene inserito nel topo (knock-in) ed espresso.

Le applicazioni sono varie:

Ad esempio si può fare una mutazione mirata (anche di un singola base) in un gene A normalmente espresso nel topo e inserirlo tramite knock-in, per vedere che conseguenze provoca quella determinata mutazione.

Oppure si può inserire un determinato gene B o un pezzo di DNA in una localizzazione diversa da quella in cui è normalmente, si possono così mimare traslocazioni.

Oppure inserire in topo un gene umano o un pezzo di gene umano (ad. Es esoni 3 e 4, mentre gli altri esoni rimangono quelli del topo)
Anche il sistema Cre-Lox è in realtà un knock-in!

Il modo per produrre topi knock-in è esattamente lo stesso di quello per i topi knock-out!
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cicciput
Nuovo Arrivato



21 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 17:42:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cicciput Invia a cicciput un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
lo so ke è 1 discussione vekkia ma mi interessa approfondire...come può essere usato il sistema Cre-lox per creare knock-in? (mi è chiaro il meccanismo di excisione mediato da Cre che provoca knock-out tessuto-specifico). Non riesco a figurarmelo a livello molecolare...
grazie 1000 in anticipo
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elly_
Utente Junior

brain blu



400 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 18:07:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elly_ Invia a elly_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dipende da come sono le sequenze loxP: se un elemento sta in un plasmide e l'altro sta nella sequenza di DNA allora c'è integrazione.
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RNA world
Utente Junior

dna



370 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 18:21:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RNA world Invia a RNA world un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per inserire delle sequenze tramite cre in regioni del genoma in cui precedentemente sono stati inseriti dei siti loxp (tramite ricombinazione omologa) si usa la tecnica RMCE, cioè recombinase mediated cassette exchange, perchè la semplice reazione mediata da cre è spostata verso l'excisione e non verso l'integrazione, quindi si usano queste cassette che contengono oltre al gene ortologo (konck-in) anche dei marcatori di selezione che spingono verso l'integrazione del costrutto.

ciao
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 19:51:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok spiego meglio questa frase visto che era mia!
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Anche il sistema Cre-Lox è in realtà un knock-in!

Intendevo semplicemente dire che quando "crei" il topo "Cre" e il topo "Lox" fai un knock-in. Il topo "Cre" è un topo normale a cui inserisci il gene per la Cre ricombinasi. Il topo "Lox" è un topo a cui sostituisci il gene X normale con lo stesso gene X fiancheggiato da due siti LoxP. Quindi sono 2 topi knock-in.
Poi quando incroci il topo Cre con il topo Lox e hai excisione del gene X allora il topo è un knock-out (tessuto specifico in genere).

Spero di aver dissolto il dubbio!

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cicciput
Nuovo Arrivato



21 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 21:54:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cicciput Invia a cicciput un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sì ora mi è chiaro
avevo capito che il sistema Cre-Lox media una ricombinazione il cui risultato è il knock-in
grazie!!!!
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ludoviva
Nuovo Arrivato



1 Messaggi

Inserito il - 01 luglio 2011 : 19:51:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ludoviva Invia a ludoviva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!Ho una domanda da porvi riguardo alla procedura del knock-in.Ipotizzando di voler inserire il mio gene al posto di un gene presente nel topo,io devo ragionare a partire dal vettore in cui avevo clonato il gene che voglio inserire oppure posso mettere il mio gene direttamente in un vettore di targeting all'interno del quale vado ad inserire le regioni di omologia con il locus bersaglio,il marcatore di selezione(ex.neo)e via dicendo.Stostudiando da 2 mesi ma mi blocco sul modo di ragionare perchè non riesco ad immaginare visivamente la procedura di knock-out e knock-in.Attendo una vostra risposta al più presto per risollevarmi il morale!Grazie a tutti.
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