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Autore Discussione  

pinocitosi
Nuovo Arrivato


Prov.: Novara
Città: novara


11 Messaggi

Inserito il - 30 luglio 2007 : 18:24:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pinocitosi Invia a pinocitosi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
avrei bisogno un'informazione.un bel sito dove si dica tutto sulle colture cellulari.... o in alternativa risposte alle mie domande..
1-perchè nell'incubatore la percentuale di co2 deve essere 5%?
2-EDTA chela calcio e magnesio..tripsina inibisce le proteine per l'adesione cellulare.. ma quanto devono agire e in che modo..? controindicazioni se usate male..
3-quanti tipi di terreni diversi ci sono?si distinguono solo per gli antibiotici presenti e per i fattori di crescita?

grazie

memole
Utente Junior

memole

Prov.: Brindisi
Città: brindisi


577 Messaggi

Inserito il - 30 luglio 2007 : 18:37:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di memole Invia a memole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao non conosco alcun sito ma posso provare a rispondere alle tua domande
1) L'incubatore va tenuto al 5% di CO2 perchè si è notato sperimentalemnte che tale condizione è necessaria per la sopravvivenza cellulare, in quanto riproduce le condizioni fisiologiche in cui le cellule si trovano nell'organismo.
2)L'EDTA è vero chela il calcio ed il magnesio, sottraendoli alla soluzione. Se non erro il magnesio è necessario alla tripsina per poter svolgere la sua azione proteasica, e quindi in presenza di EDTA non si è in grado di distaccare le cellule dal substrato (non sono certissima di tale affermazione, ho lavorato sempre su colture primarie di linfociti, che crescono in sospensione, e non ho mai tripsinizzato le cellule, per cui se ci dovesse essere scritta qualche baggianata chiedo perdono)
3) Esistono terreni di coltura diversi, contenenti quei costituenti necessari ad una cellula per sopravvivere, e che sono specifici per il tipo cellulare che si ha intenzione di coltivare. Io al terreno ho sempre aggiunto siero fetale bovino al 10%, ma so che alcuni tipi cellulari richiedono altri tipi di siero, se non erro embrionale, perchè più ricco di fattori di crescita. Si aggiungono poi la glutammina, anch'essa necessaria per la sopravvivenza cellulare, e poi antibiotico e antimicotico, specifici per il tipo di coltura che si sta allestendo.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 31 luglio 2007 : 00:37:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
2) principale controindicazione di usare troppo a lungo la tripsina: uccidi le cellule!

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Biochica
Utente Junior




285 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2007 : 09:36:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

2) principale controindicazione di usare troppo a lungo la tripsina: uccidi le cellule!



spesso trovi le indicazioni sul datasheet, comunque la tripsina va tenuta sulle cellule dai 2 ai 10 minuti al max...

comunque prova a guardare qui:
http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Cell_Culture/Key_Resources/ECACC_Handbook.html

Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
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zio
Utente Junior


Città: Napoli (IRAQ)


120 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2007 : 13:40:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova a contattare la PBI international di Milano, loro danno un corso su "colture cellulari: metodiche di base" e nell'ambito di esso distribuiscono un "quaderno" dove sono spiegate le principali metodiche specie per chi è alle prime armi.

intanto prova a collegarti qui http://www.bs.izs.it/Reparti/page_servizi-csc-home.htm e/o a contattarli. Il CSC (centro substrati cellulari)dell'IZS Brescia, tempo fa distribuiva con il catalogo anche un bellissimo quaderno con tutte le metodiche compreso le composizioni dei reagenti

PS
per quanto riguarda la tryp sulle cellule, penso che dipenda dal tipo di substrato, io per esempio su alcune linee continue che uso lascio la tryp-edta anche per un' ora e non gli fa un baffo.

zio
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Giuliano652
Moderatore

profilo

Prov.: Brescia


6923 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2007 : 14:06:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da zio

per quanto riguarda la tryp sulle cellule, penso che dipenda dal tipo di substrato, io per esempio su alcune linee continue che uso lascio la tryp-edta anche per un' ora e non gli fa un baffo.




Cribbio UN'ORA!

E' anche vero che le U373 (astrocitoma umano) le ho trattate maluccio e ora stanno bene... tipo le ho tripsinizzate, non ho tolto la tripsina ma l'ho diluita con quello che credevo fosse una soluzione di terreno e siero al 10%. Quando tre giorni dopo le ho viste ancora in sospensione ho realizzato che il siero non c'era (quindi la tripsina non è stata neutralizzata)...

Però ora stanno bene, mi è bastato aggiungere il siero!

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 08:31:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, si forse le linee continue sono molto più strong... ma dipende molto anche dalla concentrazione.

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Giuliano652
Moderatore

profilo

Prov.: Brescia


6923 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 10:07:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah beh... se si parla di primarie allora, sappi che io ho anche paura che a solo guardarle muoiano!

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zio
Utente Junior


Città: Napoli (IRAQ)


120 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 11:58:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quando si trasferiscono le colture di linee continue, in nuove piastre è necessario che tutte le cellule siano staccate dal fondo della piastra. Spesso nella coltura vi sono cellule meno aderenti che vengono staccate più rapidamente. Se si recupera solo questa quota di cellule, in poco tempo si selezione una linea poco o per nulla aderente.
Non preoccuparsi mai, quindi di esporre le cellule per un tempo eccessivo alla tripsina EDTA e controllare al microscopio l'avvenuto distacco analizzando più punti della piastra. Una leggera agitazione permette di capire se le cellule sono in sospensione o ancora aderenti.
-prima di aggiungere la tryp-edta, lavare con PBS il monostrato per rimuovere siero e cationi.
-la soluzione try-edta deve essere fresca e deve essere distribuita su tutta la superficie.
- se stentano a staccarsi: percuotere lateralmente la flask con la mano e/o prolungare il tempo di contatto a 37°.

- soluzione try 0.5%/edta 0.02% pronta all'uso.

da: manuale PBI

per l'allestimento di primarie da tessuto: ...il materiale dopo essere stato sminuzzato viene introdotto in un matraccio contenente una soluzione di tripsina allo 0.05-0.25% a 37° 10-15' per diverse volte fino alla completa disgregazione.
la tripsina è un enzima proteolitico che , alla suddetta concentrazione, a pH 7.4 e a 37° permette una rapida depolimerizzazione della sostanza intercementante delle cellule di un tessuto, senza alterarle.
(G.Poli: microbiologia e immunologia II ed.)


zio
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Giuliano652
Moderatore

profilo

Prov.: Brescia


6923 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 12:43:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:

-prima di aggiungere la tryp-edta, lavare con PBS il monostrato per rimuovere siero e cationi.



Per esperienza personale, mai letto da nessuna parte, vanno bene anche versene o la stessa tripsina per lavare

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chick80
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Inserito il - 02 agosto 2007 : 13:10:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche io lavavo con PBS, anche per eliminare eventuali cellule morte/morenti.

Per quanto riguarda le primarie, le puoi tripsinizzare ma devi essere molto delicato e veloce (per lo meno, la mia esperienza è con primarie di glia e neuroni).

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zio
Utente Junior


Città: Napoli (IRAQ)


120 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 15:22:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Per esperienza personale, mai letto da nessuna parte, vanno bene anche versene o la stessa tripsina per lavare


però fai attenzione, così rischi di perdere qualcosa nel lavarle, ci sono linee che si staccano appena gli fai annusare la sol. tryp-versene, oppure gli dai un colpetto e vengono giù

Citazione:
Per quanto riguarda le primarie, le puoi tripsinizzare ma devi essere molto delicato e veloce (per lo meno, la mia esperienza è con primarie di glia e neuroni).

indubbiamente, chick, le primarie che ho estratto io riguardavano organo di feto (renali),oppure da mastocitomi, insomma certamente più toste e poi man mano che tripsinizzavo le raccoglievo in un matraccio contenente siero fetale bovino pronto a neutrallizzare l'azione della tripsina.

zio
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Giuliano652
Moderatore

profilo

Prov.: Brescia


6923 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2007 : 16:05:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:

però fai attenzione, così rischi di perdere qualcosa nel lavarle, ci sono linee che si staccano appena gli fai annusare la sol. tryp-versene, oppure gli dai un colpetto e vengono giù



Ho visto cellule staccarsi in meno di trenta secondi, ho visto cellule staccarsi dopo che mi ero andato a prendere un caffè al bar... insomma ce n'è per tutti i gusti!

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zio
Utente Junior


Città: Napoli (IRAQ)


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Inserito il - 02 agosto 2007 : 16:21:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

zio
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Biobeth
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2009 : 09:19:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biobeth Invia a Biobeth un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti.
Io,purtroppo, ancora non sono entrata in un laboratorio ma la mia prof, per il corso di biochimica e biologia molecolare clinica, vuole che le stiliamo una sorta di protocollo sulle linee cellulari continue.
Inoltre, vorrebbe che le spiegassimo come mantenere le condizioni ideali (ad esempio come e perchè si mantiene standard il pH della coltura).
Sono, davvero in grandissima difficoltà, spero che qualcuno di voi sia tanto gentile da aiutarmi. Basta anche un link.
Grazie mille!!!
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2009 : 11:00:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova questo:
http://wapedia.mobi/it/Coltura_cellulare

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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