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 caspasi 8, TNFa, NFkB
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simoFC
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Inserito il - 12 ottobre 2007 : 12:38:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di simoFC  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di simoFC Invia a simoFC un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao,
ho bisogno di qualcuno che ne capisce qualcosa di caspasi 8!!!
vi spiego il mio problema:
studio la fibrosi cistica e mi occupo della resistenza all'apoptosi delle cell fc rispetto alle cell ctr.
ho trattato le mie cell parentali e i cloni, in cui ho overespresso IkBaM, super repressore di NFkB, con TNFa 2000U/ml per 1h,3h, 6h, e dai lisati proteici ho fatto western blot per caspasi 8.
Mi aspettavo di trovare una maggior attivazione della caspasi nelle cell in cui avevo inibito NFkB, visto il ruolo di protezione di questo fattore di trascrizione nella regolazione dell'apoptosi e un inibizione della proteina nelle cell di fibrosi cistica, che mostrano tivazione di NFkB e quindi una maggior resitenza alla morte indotta da TNFa.
Il mio risultato è esattamente l'opposto!!!!
qualcuno mi sa dare una spiegazione??
grazie!!!
simo

Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6940 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 13:12:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non ne sono sicurissimo, ma sospetto che c'entri JNK.

Inattivando NF-kappaB hai come effetto l'induzione di morte da TNFR, questa avviene sì tramite FADD e attivazione di caspasi 8, ma anche tramite stress ossidativo-->cambio stato redox della tioredoxina-->attivazione di ASK1-->attivazione di JNK-->inibizione di Bcl2-->fuoriuscita del citocromo C-->attivazone della caspasi 9

Per essere sicuro/a (scusami, non ho capito se sei uomo o donna ) potresti fare un western per JNK fosforilato, o per la caspasi 9 attivata.

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:39:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Generalmente la "spinta" che sbilancia verso la pathway TRADD-FADD-procaspasi 8
anzichè verso la pathway di attivazione di NF-kappaB non è tanto l'espressione
di NF-kappa B, quanto la diversa espressione delle molecole adattatrici
che portano all'una rispetto che all'altra pathway. No?

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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Giuliano652
Moderatore

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6940 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:44:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sì, ma se NF-kB è espresso e funzionante, in genere il TNFR attiva quella via, che risulta antiapoptotica. In letteratura si sa che "in genere" la via di JNK è attivata quasi esclusivamente se NF-kB è inibito in qualche modo. Per quanto riguarda TRADD-FADD-caspasi 8 però non ne sono altrettanto sicuro, potrebbe essere, importante anche il contesto fisiologico della cellula (come il tipo di cellula, o il suo stato di attivazione o chissà che altro...)

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simoFC
Nuovo Arrivato

scienziato

Prov.: aq
Città: l'aquila


8 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:50:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di simoFC  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di simoFC Invia a simoFC un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao giuliano652,
grazie per la tua risposta.
Ho sbattuto la testa per un anno sui western per JNK foforilato, ma non sono mai riuscita a vedere una modulazione dei livelli di espressione della proteina.
Considera che le mie parentali mostrano una over espressione di A1/Bfl, TRAF1 e cIAP2, noti target antiapoptotici di NFkB.
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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6940 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 15:05:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Riassumendo: la stimolazione con TFN attiva NF-kB (e tu mi dici che hai una overespressione di geni dipendenti da NF-kB); hai cercato JNK fosforilato ma non l'hai trovato, ora hai inibito NF-kB e cercavi la caspasi 8 (che dipende da TRADD), e che è una possibile via alternativa all'attivazione di NF-kB.

Domanda banale: JNK l'hai cercato con inibizione di NF-kB? Perché in caso contrario è normale che ce ne sia poco o nulla...

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simoFC
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Inserito il - 12 ottobre 2007 : 15:48:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di simoFC  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di simoFC Invia a simoFC un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, ho fatto western blot per JNK anche sugli estratti proteici dei cloni cellulari in cui avevo inibito NFkB, in seguito a stimolazione con TNFa breve: 10', 20', 40', 80', 160, ma non ho visto nulla.
Non so più cosa pensare perchè tutto quello che osservo è:
over espressione sia nei basali che in seguito a trattamento con TNFa di: A1/Bfl, TRAF1, cIAP2, resistenza all' apoptosi, iperattivazione di NFkB.
nei cloni in cui NFkB è inibito non osservo nulla di tutto questo, ma l'apoptosi non è mediata dalle caspasi 3 e 8, che sono invece attive nelle parentali.
Ho valutato anche l'espressione di altri geni quali: Bcl2, BclXL, p53(a livello trascrizionale e proteico) TRAF2, cIAP1 e XIAP, ma non sembrano essere coinvolti in questo contesto cellulare.

Tu riesci a trarre una spiegazione logica?
Grazie ancora
simona
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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6940 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2007 : 18:47:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per la soluzione no, purtroppo.

La 3 è l'effettrice, l'ultima caspasi... Se non è attiva quella... Uff... l'apoptosi è un casino...

Sicura che sia apoptosi e non necrosi? Morte caspasi indipendente potrebbe dipendere da stress ossidativo o altro

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simoFC
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Inserito il - 12 ottobre 2007 : 20:45:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di simoFC  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di simoFC Invia a simoFC un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sono sicura che si tratti di apoptosi perchè ho valutato la morte mediante l'utilizzo del kit CELL DEATH ELISA PLUS della roche, che quantizza la frammentazione in oligonucleosomi.

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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6940 Messaggi

Inserito il - 13 ottobre 2007 : 00:49:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'unica cosa che mi viene in mente è provare a fare un western per la caspasi 9... ma se dici che nemmeno la 3 si attiva...

Oh animo, forza e coraggio, la 3 non è l'unica caspasi effettrice! Prova la 9 e vedi se viene attivata, in quel caso c'entra il mitocondrio e non (solo) il TNFR

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gadano
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Prov.: Roma
Città: roma


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Inserito il - 15 ottobre 2007 : 10:34:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gadano  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di gadano Invia a gadano un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai provato la stimolazione con LPS+ATP invece che con TNF?
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