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magda1981
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19 Messaggi

Inserito il - 27 giugno 2008 : 14:55:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di magda1981 Invia a magda1981 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!
cerco qualche suggerimento.....
devo valutare l'espressione di alcuni geni tramite real time pcr..
inizialmente devo valutare l'efficienza del mio housekeping e del gene target!
ho provato diluendo il cDNA (1:10 1:100 1:1000 1:10000)e utilizzqndo primer 100uM; 95°C per 10 min, 95°C 15 sec e 60°C per 1 min (40 cicli)...ma ho uno slope molto basso.
mi sapreste dire quali sono le condizioni ottimali per calculare l'efficienza?
grazie mille

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 28 giugno 2008 : 00:23:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da magda1981

... utilizzqndo primer 100uM...

100uM???
Mi sembra veramente una quantità spropositata!!! Non hai sbagliato a scrivere? In genere si utilizzano attorno a 100-500nM (0,1-0,5uM), la concentrazione che hai scritto tu è 500-1000 volte superiore!!!

Comunque puoi trovare altri discussioni sull'efficienza della real time ad es queste:

http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2975
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1400
(O.T. sono passati più di 2 anni... cin, chick come eravamo giovani!!!)
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magda1981
Nuovo Arrivato



19 Messaggi

Inserito il - 30 giugno 2008 : 11:18:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di magda1981 Invia a magda1981 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ops...
si si ho sbagliato a scrivere...concentrazione primer 100nM.....
grazie gfpina
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