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Produzione di proteine eterologhe in lievito

Esiste un altro argomento che riguarda l’espressione di geni. Non prenderemo in considerazione tutti gli organismi e tutti i vettori di espressione esistenti, ma vedremo solo cosa devono avere in comune i vettori d’espressione.
Tutti devono avere una parte relativa a E.coli che permetta quindi replicazione e selezione con marcatori di selezione. in più devono avere una parte che dipenderà dall’organismo in cui io decido di esprimere il gene X, quindi un marcatore di selezione e un sistema che permetta nell’organismo in questione la replicazione autonoma se o dove è possibile.
Tutti poi hanno quella che è una cassetta di espressione, in cui ci dev’essere un sito di clonaggio in cui io posso clonare YFG, inoltre questa cassetta deve contenere elementi importanti, sia in 5’ che in 3’: io voglio che questo gene sia tracritto, che l’RNA sia stabile, dopodiché io voglio che si abbia traduzione all’interno dell’organismo (verme, pianta, topo o uomo). Per cui avrò in 5’ gli elementi che controllano trascrizione e traduzione e in 3’ segnali di terminazione della trascrizione, di poliadenilazione e, eventualmente, di splicing. questi elementi dipenderanno dall’organismo in cui io voglio esprimere YFG.

Promotori.
Possono essere costitutivi o inducibili. In genere i promotori costitutivi sono quelli della via glicolitica: (enolasi ecc.), promotori inducibili sono il classico Gal o altro. I promotori possono essere poi forti o deboli. Ho quindi un primo controllo a livello trascrizionale, scelgo il tipo di promotore: costitivo o inducibile. In genere si desidare avere tanto trascritto (accumulo) ma questo non fa molto bene alla celula (limita la crescita). Quindi scelgo un promotore inducibile: prima faccio crescere le cellule a promotore spento, poi, quando ho raggiunto una certa biomassa, accendo il sistema.

Controlli:
I segnali di terminazione in 3’, sono importanti: mi interessa avere tanto messaggero stabile.
Un altro controllo è a livello traduzionale: devo avere una buona traduzione, quindi devo metterci i giusti segnali: devo avere una corretta lettura, sappiamo infatti che il codice è degenerato ma in organismi diversi possiamo avere un uso preferenziale diverso dei codoni (in Candida Albicans quando trova CUG fa una Serina, al posto della normale Leucina: una proteina di Candida espressa in lievito può essere non funzionale, e viceversa.)
Una volta che ho tradotto il prodotto deve essere stabile, nella maggior parte dei casi si usano ceppi proteasi negativi (inibite le proteasi).
Molto spesso poi la proteina va incontro a modificazioni post-traduzionali: fosforilazione, glicosilazione, acetilazione, acilazione, formazione di ponti disolfuro, mistirilazione, gipilazione, ecc…
Io devo essere certo che l’organismo che scelgo faccia queste modificazioni. La maggior parte di queste modificazioni avvengono lungo la via secretiva, i ponti di solfuro si formano a livello di reticolo endoplasmico, che E.coli non ha. Per poter essere indirizzata lungo la via secretiva io devo aggiungere alla mia cassetta di espressione un ulteriore elemento che è la “leader sequence”, per cui ci sono dei vettori che oltre alla zona 5’ (promotore) hanno questa sequenza lunga circa da 15 a 30 aminoacidi il cui core centrale ha caratteristiche idrofobiche, e la parte N-term. è costituita da carichi. Questa sequenza è essenziale per la traslocazione a livello del reticolo, dopodiché viene rimossa (leader peptidasi). Ovviamente il promotore e la sequenza segnale devono essere in frame.
Di leader sequences ne esistono diverse, nel caso del lievito viene utilizzata spesso la sequenza segnale dell’(a)-factor, una proteina fatta lungo la via secretiva prima di essere immessa nel medium, ed è quindi caratterizzata da una leader sequenza. Un'altra sequenza leader è la suc2 che codifica per l’invertasi.
Le sequenza che io scelgo possono essere omologhe o eterologhe, in genere è meglio esprimere un prodotto eterologo utilizzando elementi omologhi al sistema, perché ovviamente verrano più facilmente riconosciuti.
Nella maggior parte dei casi indirizzo i miei prodotti lungo la via secretiva.
Il fatto di indirizzare un prodotto verso la via secretiva favorisce quello che è il folding, perché a livello del reticolo ci sono chaperonine (BIP) ed altri sistemi di modifica post-traduzionale.
È importante anche la scelta dell’ospite: in funzione dell’ospite io avrò la capacità di avere più o meno un certo tipo di modificazione.

Modificazioni post-traduzionali:
- Glicosilazione (di tipo n o di tipo o);
- Acetilazione;
- Miristilazione (attacco di un ac.miristico, in genere avviene in N-term);
- Fosforilazione;
- Acilazione (es. Ras con ac.palmitico attaccato e isopreni. Queste modificazioni avvengono a livello del C-term a livello del reticolo e dell’apparato del Golgi).
- Gipilazione (attacco di una struttura molto complessa che si chiama Glicosil Fosfatidil Inositolo, un lipide a cui è attaccato un ac.grasso, che viene attaccato un C-term alle proteine previa rimozione di una sequenza idrofobica in C-term. ad opera di una transammidasi, che taglia e attacca Questa struttura GIP. Questa struttura serve per l’ancoraggio in membrana, e ulteriormente modificata la troviamo poi in quelle proteine che ad esempio in lievito costituiscono la parete cellulare ovvero le proteine associate ai glicani che poi caratterizzano la permeabilità. Molte proteine devono essere tagliate per essere attive, un altro esempio è l’(a) factor).
- Formazione di ponti di solfuro (disulfide isomerasi)
- Assunzione del corretto folding.
Nel caso di E.coli c’è qualche problema con l’espressione, perché molte di queste modificazioni non avvengono, quindi non sempre E.coli è l’organismo migliore.
Molto spesso, se io voglio produrre, io voglio anche purificare per ottenere il prodotto, ecco perché la via secretiva è migliore: è più facile purificare qualchecosa dal medium che dover rompere le cellule ecc…

Un organismo usato frequentemente per produrre grosse quntità di proteine eterologhe è Saccorimices cerevisiae (l comune lievito):
I vantaggi sono:
- Il fatto che avvengono modificazioni post-traduzionale.
- Sistema di targeting: posso indirizzare in diversi comparti la proteina in questione.
Svantaggi:
- La N-glicosilazione avviene su un consenso di 3 residui: Asparagina–X–Serina/Treonina. Questo tipo di modificazione è abbastanza conservata e avviene a livello del reticolo (attacco del core) e a livello del Golgi (attacco delle catene laterali). Mentre il core è abbastanza conservata (pentasaccaride comune), quello che varia in vari organismi sono le catene laterali. In lievito abbiamo solo mannosi, mentre in altri organismi abbiamo strutture più complesse, quindi è chiaro che se ci sono alcune proteine la cui funzionalità è legata a modificazioni della parte glucidica (se mettiamo queste proteine in lievito, questo ci mette solo mannosi senza così ottenere una proteina corretta). In più il lievito ha un vizietto: appena vede siti di glicosilazione gli attacca glucidi, quindi spesso abbiamo fenomeni di iperglicosilazione. E siccome i glucidi sono legati a fenomeni di antigeneicità (si pensi ai gruppi sanguigni), abbiamo molto spesso dei prodotti non usabili per applicazioni via endovena. In questo caso si utilizzaranno altri organismi che avranno rese minori ma controllano meglio la glicosilazione, per esempio Pichia Pastoris, un lievito sempre gemmante che cresce su metanolo.
Gli svantaggi di Pichia è che non ha un plasmide endogeno come 2µ, e i 2µ di Saccharomices non funzionano, per cui è possibile trasformarlo solamente con integrazioni, con efficienze di trasformazione inferiori. Alternativamente a Pichia si usano alcuni funghi come gli Aspergilli, che sono organismi gras come Cerevisiae, sono ascomiceti, anche qua però c’è la trasformazione solo con integrazione.
- Un ulteriore problema è dato dallo Scaling Up industriale difficile: spesso le strategie di produzione di proteine in laboratorio non sono compatibili con le strategie di larga produzione su scala industriale, e viceversa. Questo è un problema se la proteina espressa ha un valore commerciale.

Riassumendo: per esprimere qualsiasi cosa bisogna tener conto di diversi fattori: il messaggero dev’essere stabile, il prodotto deve essere stabile, quindi o si usano ceppi proteasi negativi o si fanno proteine di fusione. Posso anche inserire qualche cosa che mi permetterà la purificazione del prodotto (TAG inseriti in C-term o in N-term, x es. targeting di Histidine ripetute: queste si legano allo zinco, quindi una volta che il prodotto di fusione viene espresso e secreto io lo faccio passare su colonne di zinco, la proteina di fusione viene immobilizzata e successivamente eluita). Molto spesso dopo questo TAG vengono messi dei segnali specifici di modo che il TAG possa essere eliminato (a me interessa la proteina), quindi io eluisco, taglio eliminando il TAG e faccio passare ancora sulla colonna, il TAG si lega e io recupero la proteina purificata.


 
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