La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un metodo attraverso
cui una sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente
in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza
amplificata o per aggiungerle nuova informazione di sequenza. È
necessario che le estremità della sequenza da amplificare
siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare
degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, e che una
piccola quantità della sequenza sia disponibile per dare inizio
alla reazione. Non è necessario che la sequenza da sintetizzare
enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; essa può
anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa,
come un segmento di un gene a singola copia nel DNA totale umano.
La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come
una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più
grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una
molecola discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle
5' degli oligomeri utilizzati.
Un tipico ciclo di PCR:
1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che
deve essere copiato (94 - 99 °C)
2. Appaiamento (annealing) di coppie di oligo, (30 - 65 °C)
3. Estensione da parte di DNApol termoresistente a partire
dai primer. (65 - 72 °C)
La scelta delle condizioni operative del ciclo (tempo
e temperatura) è compito dell'operatore, è una scelta empirica e
non prefissata.
Un passaggio graduale tra la temperatura di annealing e la temperatura
di estensione permette alla Taq di iniziare l'elongazione senza
che i primers si stacchino (T>Tm). Via via che la Taq polimerizza
la Temperatura supera i 72 °C e rincomincia il ciclo con la denaturazione.
Durante il primo ed ogni successivo ciclo di reazione, l'estensione
di ogni oligonucleotide sullo stampo originale produrrà una nuova
molecola di ssDNA di lunghezza indefinita. "Questi prodotti lunghi"
si accumuleranno in maniera lineare, cioè la loro quantità dopo
un numero qualsiasi di cicli sarà linearmente proporzionale allo
stesso numero di cicli. I "prodotti lunghi" originati in questo
modo fungeranno da stampi per l'uno o l'altro degli oligonucleotidi
durante i cicli succcessivi, e l'estensione di questi oligonucleotidi
dalla polimerasi produrrà molecole di una lunghezza definita, corrispondente
a quella della sostanza di interesse. Queste molecole fungeranno
anch'esse come stampi per l'uno o per l'altro oligonucleotide producendo
altre molecole di grandezza definita. In questo modo si svilupperà
una reazione a catena che porterà all'accumulo di uno specifico
dsDNA in maniera esponenziale rispetto al numero di cicli di reazione.
Il grado di amplificazione finale è dato da 2^(n-2) dato che i primi
due cicli sono nulli.
REAGENTI PER LA PCR.
Templato
I risultati migliori si ottengono con frammenti non superiori
a 1.5 kb. Il numero di cicli non deve superare la cinquantina, poiché
dopo un certo numero di cicli l'amplificazione non è più esponenziale
ma raggiunge un plateau dovuto a:
1. carenza di oligo,
2. carenza di dNTP,
3. aumento di PPi,
4. comparsa di DNA parassita amplificato.
Se la sequenza è ricca di GC si aggiunge DMSO (Dimetil solfossido)
e si usa la 7-aza-dGTP al posto del dGTP, ponendo attenzione che
questo non inibisca la DNA polimerasi.
Il templato può essere:
1. Omogeneo (plasmide purificato) ogni molecola è identica e rappresenta
la sequenza da amplificare, il vantaggio è che poche molecole bastano
a garantire l'amplificazione
2. Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico,
sospensione cellulari o materiale biologico) Devo usare molto DNA
per avere un minimo sufficiente per garantire l'amplificazione.
Anche la purezza e il materiale di partenza contano: l'enzima può
subire o meno impedimento sterico per raggiungere il templato. In
questi casi, caso per caso si introducono accorgimenti particolari
atti a minimizzare il disturbo.
In generale bisogna evitare tutti i contaminanti chimici che non
permettano l'attività polimerasica efficace.
Alla fine dell'estrazione dobbiamo tirare via tutto: EDTA chela
il Mg++, indispensabile per le polimerasi; gli ac.forti,
i sali che potrebbero fare complessi nel sito attivo dell'enzima
e inibirlo e, in linea teorica tutte le sostanze che interferiscono
con l'attività enzimatica (sono tutte scritte sulla boccettina di
enzima) se fra i non desiderati c'è qualcosa che è stato usato per
separare il DNA, andrà eliminato sicuramente.