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Organismi Transgenici per la Ricerca e le Applicazioni

Introduzione
Negli ultimi anni, lo sviluppo di tecniche sempre più efficienti per la trasformazione delle piante, ha permesso di utilizzare questi organismi, come sistema di produzione di molecole esogene di interesse industriale.
L'espressione di proteine eterologhe nelle piante permette la produzione di molecole proteiche con caratteristiche strutturali e funzionali molto simili alle proteine native, comprese le modificazioni post traduzionali.
Altri vantaggi dell'utilizzo delle piante come bioreattori sono i bassi costi di produzione, l'assenza o i bassi costi di purificazione, la possibilità di accumulo e di maggior stabilità delle proteine in diversi compartimenti subcellulari quali il cloroplasto o il reticolo endoplasmico e l'assenza di patogeni in comune con l'uomo.
In particolare, nell'ambito farmaceutico, è stato prodotto nelle piante, un esteso numero di anticorpi completi diversi, di derivati da anticorpi di diversi tipi, vaccini e altre proteine terapeutiche per uso medico e veterinario.

In questo contesto è stata volta l'attenzione sull'applicazione di piante transgeniche di tabacco e di lattuga per la produzione di vaccini, che possono essere somministrati per via orale.
La somministrazione orale è un approccio molto semplice e poco costoso per fornire un vaccino indirizzato alla mucosa di rivestimento dell'intestino. Tuttavia, i vaccini somministrati per questa via sono soggetti alla proteolisi nel tratto gastrointestinale. Per ovviare questo problema, è stato possibile far esprimere gli antigeni candidati in materiale vegetale ricombinante commestibile. Questo approccio offre un mezzo economico per fornire grandi quantità di vaccini in forme incapsulate per la somministrazione orale. Inoltre alcuni tessuti vegetali possono mantenere la stabilità degli antigeni per lunghi periodi di tempo a temperatura ambiente, ovviando quindi alla necessità di ricorrere alla catena del freddo durante lo stoccaggio e la distribuzione, limitando così ulteriormente i costi. Gli antigeni possono essere espressi da transgeni stabilmente incorporati nel genoma nucleare o in plastidi di una pianta ospite e l'adozione di alcuni approcci molecolari possono servire per aumentare i livelli di espressione e indirizzare la proteina espressa per un'adeguata modificazione post-traslazionale. Fusioni di molecole carrier possono inoltre stabilizzare l'antigene espresso, e facilitarne la consegna ai siti effettori nel tratto gastrointestinale.

Piante transgeniche e vaccini per la tubercolosi
La tubercolosi (TB) causata da Mycobacterium tuberculosis è una delle principali malattie infettive mortali. Lo sviluppo di vaccini anti-TB è stata riconosciuta come una delle principali priorità per la salute pubblica dall'Organizzazione Mondiale della Sanità. TB è anche la principale causa di morte nei soggetti infetti da HIV, poiché l'immunosoppressione amplifica il rischio di insorgenza della malattia.
Bacillus Calmette Guerin (BCG), un ceppo attenuato di Mycobacterium bovis è l'unico vaccino autorizzato disponibile contro TB. Tuttavia molti studi hanno dimostrato che BCG, sembra non essere un vaccino efficace contro la tubercolosi a lungo termine: nei topi, il vaccino BCG, conferisce protezione dalla malattia fino a 20 settimane dalla vaccinazione, ma l'efficacia diminuisce gradualmente, fino a perdersi completamente alla 40a settimana. Attualmente, gruppi di ricerca sono impegnati nello sviluppo di vaccini anti-TB più efficaci che possano sostituire BCG nella tubercolosi primaria o essere utilizzati come richiamo dopo una prima vaccinazione con BCG, al fine di aumentare la capacità di risposta immunitaria.  
Nello studio, che ho scelto di approfondire per la stesura di questa tesina, è stato sviluppato un sistema in cui è stata sfruttata la potenzialità dell'ingegneria genetica per costruire vaccini anti-TB utilizzando piante transplastomiche: tre antigeni candidati, ESAT-6, Mtb72F e Lipy sono stati espressi in cloroplasti di tabacco e /o lattuga ed incapsulati in compresse per la somministrazione del vaccino per via orale. Sono stati selezionati, in particolare questi antigeni perchè sono i più adatti per la costruzione dei vaccini anti-TB, essendo proteine antigeniche secrete attivamente durante la prima fase di crescita del batterio MTB.
Le sequenze codificanti per ESAT-6 e Mtb72F sono state fuse con quelle codificanti la subunità B della tossina colerica, in maniera tale che le molecole, una volta secrete si leghino ai carboidrati del ganglioside GM1, situato sulla superficie delle cellule dell'epitelio della mucosa intestinale dell'organismo ospite. Ciò garantirebbe una migliore diffusione dell'antigene attraverso i rivestimenti delle mucose, nonché un'efficiente presentazione dell'antigene a cellule dendritiche e macrofagi.
L'espressione degli antigeni TB attraverso la trasformazione del genoma plastidiale (cloroplasto, in questo caso) offre diversi vantaggi rispetto ad altri sistemi di produzione perché permette un aumento del grado di espressione dell'antigene di interesse di molte volte rispetto alla trasformazione nucleare. Inoltre, essendo i plastidi ereditati per via materna, il transgene non può essere trasmesso indesideratamente nel polline e quest'aspetto è di notevole importanza, poiché riduce il problema dell'impatto ambientale delle piante transgeniche.
L'iper-espressione di prodotti biofarmaceutici in cloroplasti facilita inoltre, la formazione di legami disolfuro e di altre modificazioni post-traslazionali e ne permette la produzione senza metodi di purificazione costosi.

Costruzione del transgene
I vettori-cloroplasto di Tabacco, PLD-CTB-ESAT6, PLD-CTB-Mtb72F e PLD-Lipy sono stati costruiti con sequenze codificanti CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F e Lipy. I vettori-cloroplasto di Lattuga, pLsDV CTB-ESAT6 e pLsDV-Lipy, sono stati costruiti analogamente, inserendo però solo le sequenze codificanti per CTB-ESAT6 e Lipy. In CTB-ESAT6 e in CTB-Mtb72F è stata inserita la cerniera gpgp (Gly-Pro-Gly-Pro) tra le proteine di fusione per ridurre l'ingombro sterico e di conseguenza facilitare il corretto ripiegamento di ogni proteina.  In questo studio, l'espressione di ESAT-6 o Mtb72F fuse con CTB e Lipy nel Tabacco, è stata presa come sistema modello, mentre la costruzione del coloroplasto trasformato di lattuga è stata realizzata per l'effettiva creazione del vaccino in capsule. La Lattuga (Lactuca sativa) è stata scelta come alternativa al tabacco perché è un ortaggio a foglia relativamente facile da coltivare ed ha un grande valore commerciale.
Per la costruzione dei vettori-cloroplasto, due geni dei cloroplasti, 16S/trnI e trnA sono stati utilizzati come sequenze fiancheggianti per facilitare l'integrazione del DNA esogeno nel genoma plastidiale nativo.
L'espressione di CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F e Lipy è regolata dal promotore psbA e dalla regione 5' UTR, che consente l'ottenimento di alti livelli di espressione, grazie alla presenza di siti di legame ribosomiali (RBS) multipli. La regione psbA 3' UTR (TpsbA), localizzata all'estremità 3' della cassetta genica, conferisce stabilità al trascritto. Il promotore Prrn è stato impiegato per regolare l'espressione del gene aadA, che codifica per l'enzima aminoglycoside 3'aminotransferasi, che conferisce resistenza all'antibiotico spectinomicina. La resistenza all'antibiotico è essenziale per la selezione dei cloroplasti trasformati. La 3'UTR del gene rbcL (che codifica per la subunità dell'enzima Rubisco), a valle del gene aadA garantisce la stabilità della trascrizione di quest'ultimo nei vettori di lattuga.

Inserimento del transgene nel cloroplasto
L'inserimento del DNA esogeno è stato effettuato mediante metodo biolistico: foglie sterili di tabacco e lattuga, completamente sviluppate sono state bombardate con particelle d'oro rivestite con DNA esogeno di pLD-CTB-ESAT6, pLD-CTB-Mtb72F, pLDLipY, pLsDV-Lipy e pLsDV-CTB-ESAT6 rispettivamente, con il dispositivo PDS1000 biolistic / He (Bio-Rad).
Dopo incubazione a 25°C al buio per 2 giorni, le foglie sono state tagliate in piccoli pezzi, successivamente posizionati su un apposito supporto per la rigenerazione degli esplanti. Dopo circa 4-8 settimane in terreno contenente spectinomicina, sono apparsi i primi germogli. Questi ultimi sono stati sottoposti a screening per verificare l'integrazione transgene mediante PCR. Le piante non trasformate non hanno mostrato nessun prodotto di PCR. Dopo l'analisi PCR, i germogli positivi sono stati sottoposti a cicli di rigenerazione e selezione per promuovere l'omoplasmia. Successivamente è stata eseguita l'analisi Southern blot per determinare l'omoplasmia o eteroplasmia e per confermare l'integrazione sito-specifica del transgene rivelata già dalla precedente analisi con la PCR.
Piante trasformate, confermate dall' analisi Southern sono state trasferite in serra per la maturazione e per la produzione dei semi.
Piante transplastomiche di Tabacco non hanno mostrato nessuna differenza visibile con le piante wild type e nelle condizioni sperimentali utilizzate è stata mantenuta sia una normale crescita che una normale morfologia delle piante (dati non mostrati nell'articolo).
Piante transplastomiche CTB-ESAT6 di Lattuga primarie (T0) hanno mostrato segni negativi di sviluppo con crescita ritardata. Tuttavia, le piante della generazione T1 erano sane e hanno mostrato una normale crescita (dati non mostrati). Inoltre semi raccolti dalle piante transplastomiche CTB-ESAT6 di lattuga T0 e semi di piante non trasformate sono stati fatti germinare su terreno contente spectinomicina, nella stessa piastra. I semi di CTB-ESAT6 di lattuga sono germinati e hanno sviluppato in modo uniforme le piante verdi (dati non mostrati). Nessuno dei semi delle piante non trasformate sono germinati sul supporto di selezione. Questa mancanza di segregazione mendeliana dei geni ha confermato eredità materna dei transgeni. Inoltre, dopo il trasferimento alla serra, tutte piante T1 fiorite hanno prodotto semi e hanno mostrato fenotipo simile quando confrontate con piante non trasformate.

Espressione delle proteine ricombinanti nelle piante transgeniche
Attraverso l'analisi Immunoblot utilizzando l'anticorpo anti CTB per le proteine CTB-ESAT-6 e CTB-Mtb72F e l'anticorpo anti-Lipy per la proteine Lipy è stato possibile rilevare i profili di espressione di ciascun tipo di pianta transplastomica di tabacco e lattuga.
-La proteina di fusione CTB-ESAT6 sia di tabacco che di lattuga era presente nelle dimensioni previste (23 KDa per la forma monomerica). Inoltre estraendo le proteine in condizioni non denaturanti e non riducenti, l'analisi Western Blot ha rilevato anche la forma pentamerica di CTB-ESAT6 (69kDa). L'analisi delle diverse frazioni di estrazione (omogenato, surnatante e pellet) della proteina di fusione CTB-ESAT6 sia di tabacco che di lattuga, ha indicato che essa si trovava principalmente nella forma solubile. Tuttavia, nelle condizioni sperimentali utilizzate, qualche proteina di fusione è stata rilevata anche nel pellet. Le proteine di fusione CTB-ESAT6 sia di tabacco che di lattuga hanno mostrato un'ulteriore banda a basso peso molecolare di circa 15 kDa. Questo frammento potrebbe essere stato formata dal taglio proteolitico della proteina di fusione. Poiché, la banda è maggiore della sola proteina CTB (11,6 kDa), il punto di rottura dovrebbe essere all'interno ESAT6. Diverse proteine CTB-fusione sono state espresse nei cloroplasti e nessuno di loro ha mostrato scissione all'interno della proteina CTB.
-Anche la proteina di fusione CTB-Mtb72F estratta dalla pianta di tabacco, ha mostrato la dimensione prevista di 83 kDa. Al contrario di CTB-ESAT6 questa proteina è stata rivelata solo nella frazione solubile.
-L'analisi immunoblot della proteina Lipy dal tabacco (Lipy-Nt) e dalla lattuga (Lipy-Ls) transplastomici, come previsto, ha rivelato la presenza della banda di dimensioni 40 kDa. Insieme a questa era presente una banda da 25 kDa, che probabilmente è stata dovuta a proteolisi della proteina Lipy, sia in lattuga che in tabacco. Come CTB-ESAT6, la proteina Lipy è stata trovata in entrambe le frazioni solubili e insolubili.

Quantificazione dei livelli di espressione delle proteine transgeniche e liofilizzazione
La quantificazione dei livelli di espressione delle proteine sia in tabacco che in lattuga transplastomiche ha dimostrato che in condizioni di illuminazione normale (16 h di luce e 8 ore di buio), il più alto livello di espressione è stato osservato in foglie mature raccolte alle ore 18, mentre è molto più basso in foglie giovani e vecchie, raccolte alla stessa ora. Il grande accumulo che si è verificato nelle foglie mature è probabilmente il risultato di un numero più alto di cloroplasti ben sviluppati e, allo stesso modo, la diminuzione dell'espressione della proteina in foglie giovani e meno giovani potrebbe essere dovuto ad un numero inferiore di cloroplasti sviluppati e in particolare nelle foglie vecchie, alla degradazione delle proteine durante la senescenza.
L'accumulo di CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F e Lipy è aumentato nel tempo durante il giorno e ha raggiunto il massimo alle ore18. Ciò può essere attribuito al fatto che la regione 5'UTR e il promotore psbA esaltano la traduzione durante le ore di luce.
Foglie di lattuga che esprimono CTB-ESAT6 sono stati congelati in azoto liquido e poi liofilizzate. La liofilizzazione delle foglie di lattuga che esprimono CTB-ESAT6 è stata eseguita per facilitare la conservazione a temperatura ambiente. Inoltre, la liofilizzazione ha permesso un aumento della quantità di antigene per grammo di materiale fogliare. L'analisi del materiale liofilizzato attraverso immunoblot con anticorpo anti-CTB ha rivelato gli stessi polipeptidi che si erano ottenuti con la foglia fresca. Un' ulteriore evidenza positiva è consistita nel fatto che non è stata osservata nessuna differenza significativa nella quantità dell'antigene nelle foglie liofilizzate conservate per sei mesi, quando confrontate con le ultime foglie liofilizzate, suggerendo che il materiale liofilizzato rimane stabile anche dopo sei mesi di conservazione a temperatura ambiente. Il materiale liofilizzato è stato quindi ridotto in polvere e confezionato in capsule per la somministrazione del vaccino per via orale.
Verifica della capacità di legame di CTB-ESAT6 al recettore GM1
Il legame con recettori GM1 è essenziale per l'assorbimento dell'antigene nell'intestino. In vivo, la proteina CTB deve possedere una struttura pentamerica affinchè possa legarsi al suo recettore GM1, in vivo.  Per valutare se la proteina di fusione CTB-ESAT6 prodotta in cloroplasti lattuga, ha mantenuto la sua funzione biologica legando il recettore GM1, è stato effettuato un saggio ELISA. CTB-ESAT6 insieme a CTB purificato hanno mostrato una forte affinità di legame con GM1. Il saggio ELISA ha dimostrato che il processo di liofilizzazione non ha prodotto nessuna alterazione sulla capacità di legame di GM1 da parte di CTB-ESAT6
Inoltre, diluizioni seriali dell'estratto fresco, delle foglie liofilizzate e di CTB purificato hanno mostrato di conseguenza una diminuzione dell'assorbanza.
Questi dati hanno dimostrato che la proteina CTB ha mantenuto la sua struttura nativa e i processi di fusione con ESAT6 e di liofilizzazione non hanno perturbato la sua forma pentamerica.

Pharming: Aspetti etici
Il "Plant Molecular Pharming" solleva importanti questioni sociali, etiche e legali per le quali non esistono risposte facili.
Il pharming ha la potenzialità di diventare una tecnologia particolarmente efficace per produrre farmaci, vaccini, sieri a basso costo e ad alto rendimento. Ciò potrebbe, non solo aiutare a risolvere alcuni dei problemi finanziari del sistema sanitario dei paesi industrializzati, ma anche a migliorare l'accessibilità ai farmaci agli abitanti dei paesi poveri che ancora oggi soffrono di carenze pesanti, nella fornitura di servizi medici.
Tuttavia, rimangono aperte molte domante circa la sicurezza ambientale, la sicurezza farmacologica, le preoccupazioni sociali, le valutazioni morali e la regolamentazione giuridica del pharming. D'altra parte, questa metodica innovativa, può suscitare incertezza sull'esatta natura e sulle dimensioni dei rischi ad essa associati. Entrambi i fattori devono insegnare a gestire le nuove tecnologie con garanzie rigorose.
Dall'altro lato però esiste anche un concreto pericolo di strumentalizzare ed enfatizzare i rischi: esiste in effetti una diffusa tendenza umana a sovrastimare i rischi antropici e a sottovalutare i rischi naturali. Si tende ad assegnare valori molto più negativi ad errori causati da interventi umani rispetto a quelli assegnati agli eventi avversi causati da fenomeni puramente naturali?
Modifiche introdotte in natura per mezzo dell'ingegneria genetica sono considerate più "artificiali", rispetto alle modifiche introdotte dalla coltivazione e dall'allevamento convenzionali, nonostante il fatto che allevamento e coltivazione convenzionali costituiscano un'introduzione intenzionale di cambiamenti genetici negli organismi, non meno significativi rispetto a quelli apportati dal DNA ricombinante, solo avvengono più lentamente. Questo, quindi non significa che ci sono più fonti di rischio che rendono piante e animali transgenici più pericolosi per la salute umana e animale, rispetto alle varietà allevate in modo tradizionale. Significa solo che per effettuare stime realistiche dei rischi bisognerebbe fare attenzione a non essere ingannati da false percezioni popolari.

BIBLIOGRAFIA
‣ Lakshmi PS, Verma D, Yang X, Lloyd B, Daniell H (2012), "Low cost tuberculosis vaccine antigens in capsules: expression in chloroplasts, bio-encapsulation, stability and functional evaluation in vitro".
‣ Henry Daniell*, Choun-Sea Lin, Ming Yu and Wan-Jung Chang, "Chloroplast genomes: diversity, evolution, and applications in genetic engineering".
‣ Kwang-Chul Kwon, Dheeraj Verma, Nameirakpam D. Singh, Roland Herzog, and Henry Daniell, "Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells".
‣ Margret Engelhard, Kristin Hagen, Felix Thiele, "Pharming, A New Branch of Biotechnology".




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