Tecnologie del DNA ricombinante
Partendo da un campione di pGEM-7zf(+), abbiamo
valutato la sua concentrazione con metodi spettrofotometrici e attraverso
elettroforesi (con confronto tra plasmide a cui è stata effettuata
una reazione di linearizazzione ed osservazione di diverse forme
di superavvolgimento nel plasmide non tagliato).
Se da una parte abbiamo reso le cellule di E. coli competenti, osservando
che erano in fase esponenziale, dall'altra abbiamo ligato un frammento
di DNA con il plasmide pGEM-7zf(+) linearizzato (osservando anche
la reazione con fosfatasi alcalina), poi confermato attraverso elettroforesi
su gel di agarosio. Trasformazione delle cellule competenti con
il plasmide ingegnerizzato e non, preparazione di miniculture, ed
osservazione dell'efficienza di trasformazione.
Amplificazione dei trasformanti (attraverso crescita su terreno
liquido dei batteri trasformati), estrazione plasmidica ed analisi
con costruzione di una mappa di siti di restrizione.
Abbiamo poi proseguito con la sequenziazione attraverso il metodo
di Ranger (con un fluorocromo) dell'inserto, sfruttando un Cycle
sequencing. Dati poi processati con BLAST e applicazioni internet,
per l'analisi e l'identificazione del sequenziato (in forward e
riverse).
Attraverso un'estrazione cromosomica in lievito, cromosoma in cui
un allele di un gene era stato sostituito da una porzione non codificante,
e successivamente una PCR con opportuni primer, è stato osservato
l'effettiva presenza o meno del mutante nella porzione in oggetto
di studio (in cui doveva esserci stata la mutazione.
Abbiamo anche eseguito, un'estrazione proteica, cromatografia per
affinità di una proteina di fusione, e sua comparazione in
tecniche di separazione come SDS-PAG e West Blotting, con un estratto
grezzo.