COSMIDI.
I cosmidi sono DNA circolare ds (come
il plasmide
pBR322) a cui sono stati aggiunti i siti cos.
Per cui io posso, mantenerlo come plasmide
in E.coli, clonare su una resistenza (pBR322 ha la resistenza per
Ampicillina e Tetraciclina), e formare grazie a cos i concatameri:
- taglio con Eco dentro una resistenza (per vedere se ho inserito
davvero -e in quale colonia- il frammento),
- linearizzo ed aggiungo l'inserto con estremità
Eco (cos sono all'interno),
- aggiungo la ligasi
Alla fine ottenendo un DNA ds lineare
concatamero che assomiglia a quello
di lambda, siccome sto lavorando in vitro, aggiungo code e teste e terminasi e, grazie a cos ho la produzione di particelle fagiche con DNA lineare ds
con estremità cos.
In questo modo possono essere utilizzate per infettare E.coli e il DNA lineare ds una volta entrato circolarizza
e si replica come un plasmide.
A differenza di lambda non devo indurre la lisi, il plasmide
originario è anche più piccolo, quindi
posso avere più spazio per il mio inserto (rispettando comunque
la lunghezza totale di 52 Kb per l'impaccamento del DNA fagico costruito).
Con i closmidi posso clonare frammenti fino a 40 Kb.
FASMIDI. (fagemidi)
Parte dal DNA fagico di lambda ma modificato. Infatti al posto dei
geni per la lisogenia ci sono pezzi
di pBR, ed
i soliti componenti tipici (ORI, resistenza, linker).
I tanti pezzettini di pBR
servono per raggiungere il TOL (lunghezza totale) di 38 Kb. Questo
molecola di DNA ha tutte le caratteriastiche di quelle originarie
del fago, e quindi può dare origine alla via fagica.
Per avere il fasmide con il frammento da clonare:
- taglio,
- aggiungo il mio inserto, grazie a cos, si formano i concatameri.
- impacco in vitro con teste vuote, code e terminasi.
Ottengo così particellefagiche
con cui infetto E.coli. Ora, o ho la replicazione come plasmidi
od ho la produzione di fagi.
La scelta se effettuare ciclo litico o meno (replicazione dei fasmidi)
la decido io, perchè nel genoma
iniziale c'era il repressore di lambda (come in tutti i fagi temperati)
temperatura sensibile: sotto ad una certa temperatura il repressore
è attivo, inibendo la espressione dei geni per la lisi.
Aumentando la temperatura, invece, inattivo il repressore, i geni
per la lisi, si attivano e ho la produzione di particelle fagiche.
Questo sistema non offre vantaggi sulle dimensioni, ma permette di
avere, a scelta la via plasmidica fagica.
Con la via plasmidica avrò una minore produzione di particelle
clonate, rispetto a quelle prodotte attraverso l'espressione fagica,
ma posso conservarle meglio (e forse più economicamente).
