Il
Chip a DNA (prodotto dalla Affymetrix) è un supporto di vetro
di 1,28 cm^2 in cui vengono direttamente sintetizzati gli oligonucleotidi
sonda; il supporto è suddiviso in molte aree, ognuna di 0,005
cm^2, contenenti 10^7 oligonucleotidi identici lunghi 20 basi che
costituiscono una parte della
sonda per identificare un determinato gene. La sonda completa per
un gene è costituita da 20 aree distinte, così ogni
gene deve essere identificato in modo molto stringente da ben 20 sonde
(identificando così anche varianti di splicing del gene). Inoltre
per evitare l'ibridazione aspecifica ogni area è fiancheggiata
da un'area di controllo. Queste aree di controllo contengono anch'esse
10^7 oligo i quali differiscono dagli oligo sonda veri e propri per
una sola base nella zona centrale. Un gene viene considerato presente
se si può evidenziare in maniera inequivocabile l'ibridazione
con gli oligo
sonda, ma non con quelli di controllo.
In
particolare per i Chip a DNA si retrotrascrive in vitro l'mRNA a cDNA,
il quale è, a sua volta, trascritto di nuovo in cRNA, utilizzando
nella reazione in vitro dei nucleotidi marcati con biotina. Con questa
reazione l'mRNA viene amplificato dalle 20 alle 200 volte. La miscela
di cRNA viene sottoposta a frammentazione, dopo di che si può
fare avvenire l'ibridazione. L'RNA legato può essere messo
in evidenza utilizzando streptavidina coniugata con ficoeritrina (derivata
dai ciano batteri, è un buon
fluoroforo). Il chip viene sottoposto a scansione, e la luce emessa
viene catturata da un microscopio confocale che ne registra l'intensità.
E' possibile poi risalire alla presenza o meno dei geni e quindi anche
ad una determinazione quantitativa dei livelli di espressione. Si
arriva ad avere
un'analisi quantitativa nell'intervallo di quattro ordini di grandezza
di concentrazione.
