Preambolo

Oggi continuiamo il viaggio tra le righe di questo misterioso neuroomicidio in seguito ad ischemia cerebrale. Per chi non avesse seguito i capitoli precedenti siamo sule tracce di un apparente cameriere innocuo che nasconde dietro di sé una inquietante storia. Questo personaggio, rappresentato dalla proteina di membrana NCX, sembra essere coinvolto nel danno ischemico del cuore. Oggi vedremo di traslare la ricerca al cervello e di capire come stanno effettivamente le cose.

I gemelli

Per chi si annoia facilmente può passare subito al prossimo paragrafo, se siete curiosi, invece, in questa sezione descriveremo un breve racconto che ci potrebbe essere utile per la nostra storia.

Sicuramente conoscerete almeno un po’ della letteratura greca e della sua mitologia che descrive l’origine di tutte le cose naturali, incluse le costellazioni. In questa ‘letteratura’  la costellazione dei gemelli presenta, per una strana combinazione, due storie diverse e contrastanti. La prima storia é quella più diffusa, che racconta dei due fratelli gemelli di Elena di Troia in cerca del vello d’oro con gli argonauti. L’altra storia meno nota, invece, racconta di un re greco che ebbe due gemelli come primo genito. Questo avvenimento era considerato un segno di sventura, poiché la tradizione dell’epoca dava al solo primo figlio maschio l’eredità reale, ed avere due gemelli comportava dividere il regno. Coscienti di ciò, l’ostetrica insieme a pochi fidati nascosero il secondo parto ed abbandonarono il fagotto lontano dal palazzo reale. Il primo figlio divenne un re buono e giusto, mentre il secondo visse nell’ombra e dovette arrancare per vivere. Quando scoprì la propria somiglianza con il regnante, pensò bene di prendersi di diritto il trono e spodestare il gemello. Nessuno si accorse dell’inganno tant’é che i sudditi avvertirono questo scambio tra gemelli come un improvviso cambio di pensiero del re, da buono e giusto ad un aguzzino sanguinario. Per chi non conoscesse il seguito della storia sono sicuro che riuscirà a trovarla con un paio di click. É curioso che ancora oggi, a causa di questa seconda origine mitologica, i gemelli sono spesso disegnati con due volti diversi, uno sereno e sorridente, l’altro cattivo.

Come in tutti i racconti greci, c’é dietro un pensiero filosofico. Probabilmente il racconto ci insegna a suo modo che i cambiamenti del comportamento possono essere determinati dalla confusione tra più persone, oppure secondo un altro punto di vista più teologico, che dentro ognuno di noi ci possono essere più personalità con lo stesso volto esteriore.

Conosci con chi vai e saprai chi sei.

Il primo punto in discussione oggi é l’uso di farmaci specifici per limitare la funzione di NCX durante il danno ischemico. Questo ci darebbe un inestimabile contributo alla comprensione del suo ruolo in senso positivo o negativo. Purtroppo, come abbiamo già accennato più volte i farmaci agiscono anche su altri bersagli, es canali ionici e recettori, quindi sono inutili. Tuttavia c’é un dubbio, perché tutti gli esperimenti fatti con queste sostanze presentano un unico risultato coincidente quando si tratta di ischemia cardiaca, mentre nell’ischemia cerebrale ci sono risultati molto discordanti?

La storia, scientifica e letteraria, ci insegna che dietro ai comportamenti ambigui ci sono sempre delle verità più profonde da scoprire. Per questo, prima di andare dal nostro indagato e sbattergli in faccia quello che abbiamo scoperto sul suo ruolo nel cuore, cercheremo ci informarci meglio sul suo conto.

La disparità dei farmaci su NCX nel cervello puzza di bruciato, appesantito poi dall’effetto convergente sul cuore. Andiamo quindi in laboratorio in cerca di maggiori informazioni. Tenendo presente la storia mitologica accennata prima cerchiamo subito di chiarire eventuali confusioni di persona. Conoscendo la sequenza del nostro gene target possiamo seguire due strade principali per la scoperta di eventuali gemelli, una via più predittiva e teorica oppure una via più sperimentale ed alchimica.

La veggenza

La tecnica più semplice oggi é quella che fa uso della bioinformatica per la ricerca di geni o pseudogeni simili al nostro indagato. Si tratta di un approccio molto economico ma che richiede un certo grado di esperienza e pazienza. Sappiamo infatti che il genoma umano, come quello di altri organismi, é stato interamente sequenziato, per cui i geni sotto gli occhi di qualsiasi curioso. Un po’ come avere un dizionario in cui compaiono tutte le parole italiane, possiamo raggrupparle in aggettivi, verbi, soggetti etc, oppure per sinonimi e contrari. Lo stesso vale per le sequenze ritrovate nel genoma umano, dove partendo da un preciso gene, si può facilmente risalire ad un suo analogo, per omologia di sequenza nucleotidica o addirittura aminoacidica.

Per farlo basta un pc, una connessione internet, qualche programma specializzato e tanta buona volontà. Il tutto dovrebbe essere condito anche con una buona dose di pazienza, poiché questa metodologia non é perfetta e capita spesso di essere abbagliati da errori, pseudogeni o sequenze che in realtà si esprimono solo in particolari cellule o particolari condizioni che non ci interessano.

Ciononostante ci armiamo di impegno e pazienza alla ricerca di geni simili al nostro imputato. Da un’analisi preliminare emerge subito che ci sono diverse sequenze simili al nostro NCX, alcune possono essere escluse poiché non portano all’espressione una proteina completa, altre non presentano i classici segni dell’espressione (expressed sequence tags = EST). Dai nostri sforzi sembrano emergere tutto e nulla contemporaneamente.

Tuttavia, valutando bene, ci sono due zone della nostra sequenza genica che sono molto conservate e si ritrovano in tante altre sequenze. Raccolte queste informazioni possiamo procedere all’identificazione degli altri possibili mRNA, e vedere per quale proteina codificano e se qualcuna di queste possa somigliare al nostro cameriere.

L’alchimia

Un seconda fase o secondo approccio potrebbe essere quello di cercare gli mRNA target direttamente su cellule o tessuto. Questo é necessario per verificare se quei candidati identificati con il pc sono poi effettivamente espressi nell’organo che ci interessa, es cervello, oppure trovare degli mRNA che ci sono sfuggiti perché magari hanno delle strutture genetiche insolite.

La seconda strada che possiamo percorrere, quindi, é alternativa alla prima ed anche complementare a questa.

In teoria, dobbiamo prendere l’RNA del tessuto o organo che ci interessa e cercare delle sequenze omologhe con la tecnica Race. Con questa tecnica, infatti, é possibile individuare i membri di una famiglia di mRNA, partendo dalla conoscenza di alcune regioni conservate.

Risultati

Dall’analisi risulta subito evidente che NCX é una proteina unica in quasi tutto l’organismo, tranne nel cervello e nel muscolo scheletrico. Definiamo NCX1, l’isoforma ubiquitaria, mentre NCX2 e NCX3 sono quelle che si trovano solo nel cervello e nel muscolo scheletrico.

NCX1, NCX2 e NCX3 sono generati da 3 geni diversi ed hanno la medesima struttura (topologia) e funzione. Sono talmente simili in sequenza aminoacidica che é possibile generare delle proteine chimeriche con pezzi di ciascuna isoforma senza alterarne la funzione e regolazione. Probabilmente la presenza di più geni con funzioni simili potrebbe essere dovuto alla ridondanza, tipica di geni molto importanti. Proprio questo é in contrasto con un possibile ruolo negativo.

Da qui la prima possibile spiegazione sui farmaci, probabilmente hanno selettività diverse per le isoforme di NCX e di conseguenza hanno anche risultati diversi. Se prima eravamo in dubbio sul ruolo di una singola proteina, adesso ne abbiamo tre. In pratica ci siamo avvicinati al vero e ci siamo accorti di essere notevolmente distanti dal concludere le indagini.

Qual é il ruolo di queste proteine?

Quando le cose si complicano é meglio semplificare.

Per capire bene la funzione di ogni singola proteina andiamo in laboratorio e transfettiamo stabilmente queste proteine in altrettante linee cellulari. In questo modo possiamo evidenziare il comportamento individuale di ogni isoforma e nel contempo siamo in un sistema più facile da controllare ed analizzare.

La prima notizia é che le cellule costrette ad esprimere questo scambiatore sembrano non soffrirne affatto in condizioni fisiologiche. Se però volessimo considerare delle condizioni patologiche, ad esempio un overload di calcio?

Per sovraccaricare di calcio le cellule possiamo aggiungere al mezzo la ionomicina, una sostanza tossica che forma dei pori sulla membrana plasmatica e fa entrare quantità massicce di calcio. Le cellule wild-type muoiono poco dopo l’incubazione, mentre le cellule che esprimono NCX sopravvivono senza difficoltà.

Tutte le isoforme, NCX1, NCX2, e NCX3 hanno lo stesso effetto protettivo in egual misura, ma qualcosa non quadra; stessa funzione=stesso ruolo?

Se proviamo a testare i farmaci incriminati ci accorgiamo subito che c’é una discreta selettività. Alcuni farmaci agiscono su una isoforma in particolare, altri farmaci agiscono solo in determinare condizioni ioniche. L’ipotesi premessa sembra essere vera e quindi la strada farmacologica non é percorribile.

Sorpresa!

Nella ricerca, come nelle indagini poliziesche, può capitare spesso di essere abbagliati e di semplificare troppo le cose, ora ne vedremo un esempio.

Questa volta cerchiamo di sottoporre le cellule a stimolazioni più simil-ischemiche, non più solo sostanze tossiche. Una possibilità é di sottoporre le cellule che esprimono ciascuna isoforma ad una deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD). In questo modo il modello é più complesso e simile all’ischemia, vedremo quale proteina ha un effetto protettivo e quale ha un effetto letale.

I risultati sentenziano che NCX3 é l’unica proteina con capacità protettiva in quelle condizioni. NCX2 e NCX1 sembrano non avere alcun effetto.

La situazione sembra essere interessante, ma perché le due proteine NCX1 e NCX2 non fanno nulla durante l’OGD mentre sono fondamentali nell’overload di calcio con la ionomicina? Dopotutto hanno la stessa struttura e funzione di NCX3. Qui é la sorpresa, presi per la gola ed interrogati per bene, NCX1 e NCX2 confessano entrambi che seppur  non consumino ATP per funzionare, in realtà l’ATP stesso é un regolatore della funzione degli scambiatori. I pratica in assenza di questa molecola i due indagati non agiscono, anche se in teoria potrebbero. Ovviamente durante l’ischemia cerebrale c’é una carenza di ATP e questo avrebbe bloccato ogni azione di scambio ionico proprio come avverrebbe per le pompe ioniche. NCX3 invece é diverso e non é regolato dalla presenza di ATP, quindi era l’unico che poteva agire inisturbato, ma per fare cosa?

Una nuova strategia

Tenuto conto che il nostro sospettato é NCX3, e che in vitro sembra essere neuroprotettivo, andiamo a vedere cosa succede in vivo durante l’ischemia cerebrale vera.

Per farlo possiamo utilizzare una nuova strategia interessante, ovvero abbassare l’espressione del nostro indagato con gli oligonucleotidi antisenso o con l’RNA interference direttamente nell’animale vivo. Il risultato é sconcertante, basta anche un lieve abbassamento dell’espressione di NCX3 per causare un notevole peggioramento del danno ischemico.

A qesto punto possiamo effettuare la prova del nove; ovvero generiamo un topo ko per NCX3 e verificare se ciò è confermato. Il topo ko sembra essere vitale e non avere alcun problema, sottoposto ad ischemia cerebrale i dati ci danno ragione. I topi ko per NCX3 presentano un volume ischemico notevolmente maggiore rispetto ai loro fratelli wild-type, soprattutto nelle prime fasi del danno. Tra tanti assassini abbiamo trovato un prode paladino della nostra sicurezza.

Se questa fosse una storia di fantasia…

Se questa fosse solo una storia di fantasia terminerebbe qui, con un buon presagio ed un possibile target farmaceutico per limitare l’estensione del danno cerebrale. Purtroppo spesso la realtà é molto più sorprendente di tutti gli scrittori di gialli. La storia non finisce qui, infatti, poiché su due autorevolissimi giornali scientifici, cell e nature, compaiono due articoli su un argomento che già era nell’aria da un po’ e che cambierà drasticamente la visuale della nostra storia.

La notizia

Tutti i ricercatori che hanno trattato direttamete o indirettamete la proteina NCX3 sapevano già da tempo che nei western blot degli estratti cerebrali compaiono diverse bande oltre a quella corrisponde ad NCX3. In realtà non si ha ancora un anticorpo monoclonale per questa isoforma e neppure un policlonale perfetto per cui spesso si è tralasciato una scottante verità. Durante l’ischemia cerebrale l’espressione di NCX3 tende a diminuire nel centro dell’ischemia, mentre aumenta nelle zone peri-infartuate. Qualcosa richiama l’attenzione sul fatto che i neuroni attorno all’area ischemica tentano di esprimere le proteine di emergenza perché si trovano sul fronte ischemico e vogliono resistere. Tuttavia all’improvviso, queste stesse cellule perdono l’espressione di NCX3 e muoiono di lì a poco. Il western delle aree ischemiche, infatti, é povero della banda di NCX3, mentre compaiono invece altre bande a basso peso molecolare.

L’articolo pubblicato su cell dimostrerà, infatti, che durante l’ischemia cerebrale ‘qualcuno’ dall’interno uccide NCX3 poiché é proprio l’ultima difesa del neurone per la sopravvivenza. Si tratta di una serie di tagli netti in più punti che provocano la scomparsa di NCX3 intero dalle cellule e la comparsa di una serie di bande proteolitiche.

Uno shock dunque ripreso anche da Nature sul dubbio della selezione naturale e perché abbiamo un vero e proprio assassino nel nostro cervello che, agendo nella confusione, taglia e degrada in maniera specifica e selettiva proprio le nostre difese migliori lasciando intatte NCX1 e NCX2 ferme a guardare poiché sono impossibilitate ad agire in assenza di ATP.

Conclusioni

In questa lunga puntata shock abbiamo scoperto ancora una volta la complessità del caso e soprattutto una volontà programmata di uccidere i neuroni. C’é sicuramente un mandante dell’omicidio e che sa bene il fatto suo, poiché degrada in maniera chirurgica solo le proteine che servono per le nostre difese, lasciando intatte quelle che non possono comunque fare nulla.

Alla prossima

Pasquale

L’Orecchio: l’AP come nuova risorsa (Parte III)

Continuo di: L’Orecchio: Piccoli Dettagli (Parte I)

Continuo di: L’Orecchio: Assoluto o Relativo? (Parte II)

Preambolo

Nei precedenti post 1 e 2 ci siamo occupati di due argomenti apparentemente casuali: le origini delle note musicali e di questa strana caratteristica chiamata Orecchio Assoluto. Ora ci occuperemo della correlazione tra le due cose e vedremo cosa ne uscirà fuori.

Buona Lettura

Qual è l’interesse neuroscientifico dell’AP?

Leggendo i post precedenti sembra esserci un interesse puramente musicale nell’AP e nelle origini delle note stesse, ma in realtà c’è un discreto interesse neuroscientifico. L’orecchio assoluto, infatti, è un chiaro esempio di come un’abilità possa essere così strettamente correlata ai processi neuronali del cervello fino ad ora ignoti.

Ora cercheremo di concentrarci su dove possa poggiare l’AP per i suoi effetti.

In altre parole, da cosa dipende l’AP in un soggetto?

Differenze della struttura dell’orecchio?

La prima domanda è se la percezione della musica intesa come struttura dell’orecchio e la generazione del segnale che arriverà al cervello è la stessa in soggetti AP e soggetti non AP. I dati scientifici obiettivi indicano che entrambi i gruppi sperimentali hanno delle orecchie che generano gli stessi segnali e non c’è alcuna differenza significativa nella qualità (risoluzione) del suono percepito.

Suono differito?

Una cosa fondamentale per la percezione è sempre la velocità di flusso del segnale percettivo dalla periferia al cervello e poi, non meno importante, la simmetria dell’effetto stesso. Anche una lieve differenza tra le velocità dei segnali che raggiungono l’emisfero destro e sinistro può portare a ‘malessere’ o cattiva percezione ed interpretazione della sensazione.

Nel caso dell’orecchio c’è una fisiologica differenza di velocità del segnale dai sensori del suono fino agli emisferi, in pratica in tutti noi il segnale sonoro percepito raggiunge prima l’emisfero sinistro e dopo l’emisfero destro, questo tempo intercorso tra le due percezioni possiamo definirlo ‘differimento’.

Nei soggetti non-AP c’è un notevole aumento del tempo di differimento, in altre parole il segnale sonoro percepito raggiunge l’emisfero destro con maggiore lentezza rispetto ai soggetti AP.

Questa analisi è addirittura in accordo con gli studi fatti sulla mancanza di specularità delle capacità di identificazione del suono da entrambe le orecchie. I soggetti non-AP sbagliano più frequentemente quando ascoltano il suono solo con l’orecchio sinistro rispetto all’orecchio destro, suggerendo che è proprio l’emisfero destro ad essere più inefficace nell’identificazione del suono.

Differenze cerebrali?

Gli studi neuroanatomici hanno mostrato da tempo che i soggetti AP mostrano una maggiore asimmetria cerebrale nell’estensione tra regioni di destra e di sinistra in alcune aree che sono strettamente correlate alle funzioni verbali, come ad esempio nel planum temporale. C’è anche uno studio che dimostra una corrispondenza tra la grandezza assoluta del planum temporale destro e la possibilità di essere un AP. Anche questi studi contribuiscono ad attribuire all’emisfero destro un ruolo principale nell’AP.

Causa o effetto?

Sappiamo bene che il cervello è un organo plastico e che può ipertrofizzare o atrofizzare in relazione con l’esercizio o la stimolazione. Non è chiaro dunque se le differenze morfologiche cerebrali tra i soggetti AP e soggetti non-AP determinano di per sé una differenza nelle capacità cognitive oppure è la capacità di capire le note che ipertrofizza alcune aree cerebrali.

Rispondere a questo punto non è facile.

Differenze funzionali?

Come abbiamo visto, basarsi sulle dimensioni e sulle velocità di conduzione del segnale nervoso non basta, bisogna anche collocare la funzionalità cerebrale con l’AP. Per fare questo è possibile utilizzare una tecnica che permette di visualizzare le zone del cervello messe in funzione al momento dell’esecuzione di un compito preciso; trattasi della tomografia a emissione di positroni (Pet).

Attraverso esperimenti fatti con questa tecnica, si è visto che la corteccia prefrontale dorsolaterale sinistra, area coinvolta nella memoria associativa condizionale, é iperattiva fra gli “assolutisti” in fase di ascolto. Il tipo di memoria di quest’area cerebrale sarebbe proprio quella che ci si aspetterebbe quando si devono dare risposte diverse ad altrettanti stimoli diversi, come avviene nell’AP.

Aggiungendo questo forte indizio con i precedenti, potremmo dedurne che il cervello sinistro contribuisce con una memoria quasi istintiva allo stimolo, mentre il cervello destro contribuisce all’associazione sonora.

Come avviene il riconoscimento delle note?

Un piccolo spiraglio emerge dalle ricerche fatte. Partendo dal presupposto che non ci sono differenze nella risoluzione delle frequenze dei suoni percepiti (qualità), potremmo ipotizzare delle differenze nell’abilità di riconoscimento del nome della nota, piuttosto che il suono stesso. Bhé, insomma, io potrei vedere un conoscente, individuarlo e sbagliarne il nome, oppure potrei vedere un conoscente e percepirlo come un’altra persona e quindi dare un nome diverso. Non è facile capire quali dei due meccanismi è fallace nei soggetti non-AP tra il riconoscimento della frequenza e l’associazione del nome della nota.

Recentemente, un lavoro pubblicato su Plos One ha dato degli interessanti sviluppi a tal proposito. Partendo dal presupposto che il nome delle note è perfettamente casuale (vedi post precedente), ci dovrebbero essere le stesse difficoltà nel riconoscere tutte le note Do, Re, Mi… ma questo non è vero.

Seguendo la logica, infatti, ci si aspetterebbe che un soggetto confonda più frequentemente suoni che hanno una frequenza molto simile a quella di riferimento es Do-Re (261-293 Hz) oppure Sol-La (392-440 Hz). Nella realtà, invece, è più frequente la confusione tra note che hanno le stesse vocali nel proprio nome, es Do-Sol (261-392 Hz) rispetto a Do-La (261-440 Hz) sebbene non ci sia alcuna maggiore o minore somiglianza nella frequenza della nota stessa.

A supporto di questo strano comportamento bisogna dire anche che quando il soggetto non-AP è portato a scegliere tra due risposte, migliora la propria performance se sono presenti due note con vocali diverse Do-La, ed ha quasi un 50% di performance quando sono presenti due note con vocali uguali Do-Sol. Anche questi risultati sarebbero incomprensibili senza tener conto di un effetto psicologico ed interpretativo causato dal nome delle note stesse piuttosto che da una propria percezione. Secondo uno studio fatto su più di 2.000 persone, la nota più facilmente riconosciuta da soggetti AP e soggetti non-AP è il Re, probabilmente alla luce di questi dati potremmo interpretarlo come molto probabile, poiché è l’unica nota della scala musicale ad avere la vocale ‘e’ nel nome, quindi c’è minor rischio di confusione. D’altra parte le note diesis o bemolle presentano una frequenza di riconoscimento tra le più basse.

Come si comportano gli anglosassoni?

Tenendo per buoni questi dati scientifici, potremmo osservare gli anglosassoni che non hanno dato alle note alcun nome, rimanendo quindi ancora con le lettere dell’alfabeto C, D, E, F, G, A, e B. Le possibili confusioni tra le note sono le stesse dei latini? La risposta è no.

Si mantiene la capacità di discriminare il Do (C) con il La (A), ma non il Do (C) con il Re (D). Indagando bene, le note C, D, E, G e B condividono egualmente la vocale ‘/i:/’ nella pronuncia inglese e quindi sono egualmente confuse nei soggetti non-AP e presentano anche una eguale maggiore frequenza di errore nei soggetti AP. Le note F (pronunciata con /e/) e A (pronunciata con /ei/) sono le note maggiormente riconosciute dagli anglosassoni, probabilmente perché presentano anche vocali uniche.

Come si comportano gli asiatici?

Gli asiatici hanno note con nomi totalmente diversi da quelli a cui siamo abituati a pensare. Lì purtroppo tutti i nomi delle note presentano la stessa vocale, generalmente la ‘/a/’, anche se si usano tonalità diverse per i nomi. Sebbene queste condizioni non soddisfino a pieno la teoria delle vocali, questa teoria è l’unica a spiegare molto bene la diversa capacità delle note di essere riconosciute e soprattutto la diversa capacità di riconoscere le note tra popolazioni geneticamente molto simili e che usano solo annotazioni musicali diverse.

Conclusioni

Ovviamente non c’è alcuna presunzione di raccontare una verità assoluta, né di essere certi di aver interpretato tutto. L’AP è un fenomeno che andrebbe indagato più a fondo, fino alle radici verbali, dove probabilmente scopriremo nuovi processi cerebrali di formazione del linguaggio, di memoria e di interpretazione che tutt’oggi ci sfuggono.

Per ora immaginerei un mondo in cui ciascuna nota avesse un nome con una vocale diversa… magari in questa popolazione ci potrebbe essere una percentuale di soggetti AP maggiore rispetto a quella dell’attuale popolazione mondiale (0.0001%).

Alla Prossima

Pasquale

L’Orecchio: Assoluto o Relativo? (Parte II)

Preambolo

Nel post precedente abbiamo preso in esame il suono ed abbiamo accennato all’origine della musica e dei nomi delle note. In questa seconda parte prenderemo in esame le conseguenze di tali scelte nella percezione ed interpretazione del suono per il cervello.

L’orecchio assoluto e l’orecchio relativo

Le coordinate di oggi sono determinate dalle capacità di ‘ascolto’, non in senso letterario, piuttosto nella comprensione delle note musicali come fossero parole. Secondo questo schema possiamo dividere le persone in due categorie principali, quelle che posseggono un orecchio assoluto (meglio definibile con orecchio perfetto) e le altre che hanno un orecchio relativo.

Si intende per orecchio assoluto (absolute pitch: AP) la capacità di identificare una nota musicale senza nessuna altra nota di riferimento, mentre quelli che hanno l’orecchio relativo sanno paragonare due note e due strumenti solo se suonati insieme o a breve distanza.

Per intenderci, quasi tutte le persone con un minimo di cultura possono notare un cantante stonato, uno strumento che non è ben accordato o due note che non sono uguali (orecchio relativo), ma è difficile sentire un singolo suono e determinare quale nota sia senza paragonarla ad un’altra nota di riferimento (orecchio assoluto).

La parola orecchio assoluto suscita nell’ambiente musicale un senso di fascino e mistero, sembra essere presente nel 20% dei musicisti, e solo nel 0.0001% della popolazione totale.

Questa capacità insorge nei bambini piccoli in quella misteriosa fascia di età compresa tra i 6 mesi ed 1 anno di vita (vedi post), ma è genetica? Culturale? Dovuta a stimolazioni esterne? O semplicemente casuale?

Genetica o casuale?

Certamente l’AP non è una caratteristica che si può assumere da adulto, sebbene esistano degli esercizi difficilissimi per avvicinarsi molto all’orecchio assoluto (ear training).

Da un primo approccio si potrebbe definire il fenomeno come un fattore casuale o una predisposizione genetica, poiché nella maggioranza dei casi si possiede un orecchio assoluto in maniera indipendente dalla presenza di musicisti e di mestieri correlati ad esso in casa. Molte di queste persone speciali non sanno nemmeno di avere questa particolarità.

Tuttavia è stato dimostrato anche che la crescita di un bambino in un ambiente musicale facilita l’acquisizione di questo dono. Come poter conciliare questi concetti? Da un lato c’è una maggiore frequenza di AP in soggetti che crescono in ambienti ricchi di musica, il che indica un’acquisizione per esperienza. Dall’altro lato bisogna spiegare anche la presenza di AP in soggetti che non hanno alcun rapporto con la musica e posseggono lo stesso dono.

Per capirci potremmo estendere il significato di ‘musica’ dal punto di vista di un bambino di 6 mesi, poiché é  stato dimostrato che in questa fase il soggetto non avverte la differenza fra la lingua madre e una straniera, anche se riconosce dei suoni in maniera istintiva (pianto di un altro bambino, suono amorevole, ninna nanna, battito cardiaco materno).

In queste condizioni il suono di una sillaba potrebbe essere molto simile a quella di una nota, ed una parola simile ad una piccola serie di note; quindi si potrebbe intendere come ‘musica’ anche la lingua materna o dei familiari/amici. A supporto di questa teoria è stato dimostrato da tempo che nelle lingue asiatiche c’è una maggiore percentuale di possessori di questo prezioso dono, probabilmente perché i bambini sono esposti ad una lingua con in cui parole hanno un significato diverso a secondo della tonalità con la quale sono pronunciate le “vocali” (lingua tonale). In ‘mandarino’, per esempio, il suono ‘ma’ può significare “mamma” oppure “cavallo” secondo l’altezza del suono. La particolare attenzione a questi dettagli, quando si ascolta o quando si parla, in un bambino potrebbe contribuire ad affinare o far rimanere l’abilità di riconoscere le frequenze sonore, che è poi trasferita allo studio della musica.

Seguendo questo schema, potremmo definire la causa di questo dono con una spiccata attidudine ad ascoltare i suoni con molta attenzione da una parte, ed ovviamente una stimolazione giusta della madre o dell’ambiente che circonda il bambino in quei preziosi momenti.

A supportare questa teoria ci sono anche gli studi fatti sui non vedenti congenici ed i malati di autismo che presentano questa strana caratteristica con un’altissima frequenza, senza per altro averla ‘ereditata’ da parenti ‘musicisti’.

Solo verso il nono mese, mediamente, incomincia ad essere chiara l’associazione tra una parola ed i suoi effetti, ovvero, anche se il bimbo non riesce ancora ad esprimersi a parole è in grado di capire seppur grossolanamente cosa gli viene detto.

Correlazione genetica?

Bisogna dire anche che l’associazione delle popolazioni con l’AP é il pomo della discordia, poiché considerando il punto di vista di un genetista, una popolazione asiatica ha un corredo genetico che differisce da quello europeo/americano. Alcuni geni o alleli eventualmente presenti nelle popolazioni asiatiche potrebbero favorire l’acquisizione dell’AP.

Indagando più a fondo, infatti, i coreani e i giapponesi hanno una frequenza di AP molto alta senza avere una lingua tonale. Anche gli asiatico-americani che parlano esclusivamente l’inglese e che non sono stati esposti alla lingua asiatica durante l’infanzia hanno una accertata alta ricorrenza di AP.

Una differente distribuzione di AP tra le popolazioni può essere spiegata meglio con delle differenze genetiche.

I primi ricercatori che tentarono di dimostrare questa teoria furono Profita e Bidder che riportarono nel 1988 un’elevata ricorrenza di AP in alcuni alberi genealogici e conclusero che l’AP viene ereditato come un tratto autosomico dominante con penetranza incompleta. Per approfondire l’argomento Baharloo e colleghi, nel 1998 riportarono una consistente aggregazione familiare dell’AP e indicarono un possibile ruolo dei meccanismi genetici nello sviluppo dell’AP.

Da un altro studio è emerso anche che un’istruzione musicale precoce dà più possibilità di avere un AP nell’età adulta se si è parenti di primo grado di un soggetto con AP. Questi dati confermano la possibilità di una componente genetica dell’AP.

Tuttavia questa ipotesi è indebolita da una serie di dubbi. Questi studi sono stati fatti esclusivamente su musicisti che ovviamente hanno dato un ambiente musicale ai propri parenti di primo grado, il che favorirebbe l’acquisizione dell’AP attraverso un fattore ambientale e non genetico.

Musica come linguaggio?

Ancora oggi non è chiaro quanto partecipino l’elemento genetico e quello ambientale alla formazione dell’AP, tuttavia è probabile che la capacità di identificare le note musicali derivi da un processo neurologico che corre parallelo a quello di acquisizione delle capacità linguistiche. In sostanza l’orecchio assoluto potrebbe essere il risultato di un rapporto biunivoco fra linguaggio e suono, dove la capacità di distinzione tonale viene mantenuta e inserita nel sistema tassonomico del linguagio musicale, parallelo a quello verbale.

Per intenderci, si immagini Beethoven che riusciva a scrivere la musica senza suonarla come un romanziere potrebbe essere in grado di scrivere un racconto senza sentirlo mai leggere alta voce, ed un musicista che scrive su uno spartito le ‘parole’ sentite da un pianoforte. La corrispondenza con il linguaggio sarebbe perfetta come associare alle vocali ‘a’, ‘e’, ‘i’, ‘o’, o ‘u’ con la corrispettiva lettera rappresentativa.

Conclusioni

Bisogna dire anche che avere un orecchio assoluto in realtà non facilita certamente il poter suonare meglio di altri, piuttosto spinge chi ha questo dono ad apprezzare molto più a fondo la musica e le relative note sotto tanti aspetti che ai più sfuggono. Con l’orecchio assoluto magari sarà più facile accordare uno strumento senza punti di riferimento, ma potrebbe essere anche più difficile suonare con l’accordatura ad una tonalità diversa (fare una trasposizione), come suonare ad esempio il clarinetto, il sassofono, il corno, poiché sono accordati in tonalità diversa da quella di Do. In altre parole, sebbene l’orecchio assoluto sia comunque un vantaggio, per un musicista avanzato è solo uno strumento in più che può utilizzare. L’ideale sarebbe avere entrambe le caratteristiche per poter dare il meglio.

Nel prossimo post cercheremo di entrare ancora più in dettaglio sull’origine dell’orecchio assoluto.

Continua: L’Orecchio: l’AP come nuova risorsa (Parte III)

Alla prossima

Pasquale

L’Orecchio: Piccoli Dettagli (Parte I)

Preambolo

Dopo aver preso in esame l’olfatto, ora vedremo un altra misteriosa percezione che mi sta molto a cuore; l’udito.

Sicuramente si tratta del più evoluto dei proverbiali 5 sensi, poiché é stata la fonte per le nostre intercomunicazioni sociali al più alto livello. Mediante la comunicazione abbiamo organizzato battute di caccia di gruppo, abbiamo chiesto aiuto, ci siamo accorti del pericolo e poi abbiamo cominciato a discutere di problemi, sentimenti fino ad arrivare alla poesia ed alla musica.

Il suono

Come al solito è necessario qualche punto di riferimento per metterci d’accordo e questa volta inizierò con la definizione di suono. Non vi è alcun dubbio che per suono si intenda una forma di energia cinetica (di tipo vibrazionale) che si propaga mediante un mezzo (aria, acqua, o altro) fino a raggiungere il nostro orecchio che ce lo rende percettibile attraverso il timpano e comprensibile attraverso connessioni nervose.

Il suono come energia

L’esempio più percettibile del suono inteso come propagazione di energia è quel fenomeno ben noto ai vecchi musicisti che accordavano il proprio strumento con il diapason. Il diapason, per chi non lo sapesse, è generalmente un pezzo di metallo a forma di Y che una volta colpito vibra con una particolarissima frequenza (440 Hz) chiamata ‘LA’ (in americano ‘A’). E’ utilizzato come suono di riferimento per accordare uno strumento (ad esempio la chitarra) sulla nota musicale LA, e poi da questa accordatura si possono ottenere tutte le altre note per trasposizione.

E’ esperienza comune che quando lo strumento è accordato bene, basta semplicemente avvicinare il diapason vibrante alle corde della chitarra per far vibrare magicamente la corda del LA senza toccarla. Quando ero giovane e suonavo la chitarra stupivo sempre mio cugino piccolo con questo fenomeno ben noto con il nome di risonanza. La spiegazione è semplice, l’energia cinetica del diapason riesce ad interagire in fase con la corda bersaglio che ne acquisisce l’energia, un po’ come sull’altalena, in cui c’è bisogno di dare la spinta con una certa frequenza per generare ed aumentare l’oscillazione del sellino. Questo fenomeno è valido a tutti i livelli tanto che il termine è stato poi traslato anche in altre discipline, come ad esempio nella chimica-fisica dove il termine di risonanza ed energia compatibile sono molto usati.

La musica nella scienza

L’insieme strutturato ed armonico di suoni è senza alcun dubbio la musica e l’importanza di questa arte nella nostra specie non ha eguali in natura ed é anche correlata strettamente alle scienze. L’origine stessa della musica si perde nella preistoria ed è progredito parallelamente al nostro linguaggio fino ai tempi moderni. La perfetta correlazione tra la musica, la matematica, la scienza e l’arte non ha eguali.

Non a caso il premio Nobel per la letteratura Hermann Hesse, nel suo mirabile capolavoro ‘il gioco delle perle di vetro‘ (1943) mette al centro dell’universo scientifico proprio la musica. Il romanzo di fantasia ambientato in un lontano futuro, infatti, parla di una tale frammentazione scientifica per le eccessive specializzazioni che non é più possibile una intercomunicazione tra i ricercatori. L’obiettivo del gioco delle perle di vetro é proprio quello di coniugare argomenti apparentemente tanto lontani in un unico concetto condiviso. Tra queste arti, proprio la musica é il principale capostipite, in quanto é già di fatto armonia di matematica, fisica, energia, ingegneria, arte, cultura, linguaggio e sentimento poetico in maniera semplice.

Le note come nomi

Sappiamo tutti che a seconda della frequenza di vibrazione (Hertz) del suono si possono definire delle note raggruppate in periodi (ottave). L’insieme delle note stesse formeranno la musica la cui origine si perde nella preistoria.

Fin qui tutto già noto, ma pochi sanno che la musica ha avuto un ruolo sociale di intercomunicazione che è progredito parallelamente al linguaggio durante la nostra evoluzione, quindi ha quantomeno centinaia di migliaia di anni. Tuttavia, la formalità di questa arte, intesa come scrittura è recentissima, meno di un secolo.

Se prendiamo in esame i nomi ed il numero delle note, infatti, é solo un caso che si é concordati all’uso iniziale di 7 note periodiche a cui sono state aggiunte successivamente altre 5 (diesis o bemolle).

Anticamente si usava una notazione di origine greca che utilizzava le lettere dell’alfabeto α, β, γ etc per indicare le note. Tale notazione è ancora in uso nei paesi di lingua inglese con le lettere latine:

A = La, B = Si, C = Do, D = Re, E = Mi, F = Fa, G = Sol

Successivamente sappiamo che questa notazione è stata cambiata, tuttavia pochi sanno che il nome attuale delle note non é riferito al suono onomatopeico (tipo “bau” per l’abbaiare dei cani e “miao” per il miagolio dei gatti), bensì ad una convenzione stabilita arbitrariamente da Guido d’Arezzo nel XII secolo. Il nome delle note corrisponde al nome delle sillabe iniziali dei primi sei versetti dell’inno “Ut queant laxis”

« Ut queant laxis | Resonare fibris | Mira gestorum | Famuli tuorum | Solve polluti | Labii reatum, | Sancte Iohannes »

Traduzione

« Affinché i tuoi servi possano cantare con voci libere le meraviglie delle tue azioni, cancella il peccato, o santo Giovanni, dalle loro labbra indegne »

Nel XVI secolo la settima nota riceve il suo nome definitivo ‘Si’ e nel XVII secolo in Italia la nota ‘Ut’ viene sostituita con il nome attuale Do (da Dominus o da quello che l’ha proposto Giovanni Battista Doni) per la difficile pronuncia. In Francia questa modifica non venne fatta, e ancora oggi si usa il nome “ut” per la prima nota.

Cosa c’entra il suono con le Neuroscienze?

Una volta, in un seminario del nostro dottorato ci venne a trovare un professore che provò a spiegare cosa fosse e dove si trovasse la nostra coscienza. Non ricordo nulla di interessante in quelle parole, ma una cosa mi affascinò molto:

Nel primo anno di vita, un bambino, con tutto il rispetto, è molto simile agli animali per quanto riguarda la coscienza della propria esistenza nel mondo. Lo si può notare quando portate un bambino di circa 6 mesi di fronte ad uno specchio, noterete che il primo approccio è quello di salutare, afferrare o interagire con l’immagine sua riflessa senza rendersi conto che quell’individuo risponde ai propri movimenti. In seguito ad una esposizione più lunga i bambini mostrano una quasi totale indifferenza a quello strano vetro magico, in pratica capiscono che è un trucco e non tentano più una interazione. L’approccio dei classici animali domestici di frone al ‘vetro magico’ é lo stesso. Chi ha un cane o un gatto avrà sicuramente notato una interazione in una prima fase, poi una totale indifferenza.

Nell’uomo però c’è una rivoluzione sostanziale che, se non fosse blasfemo, potremmo definire miracolosa. Un bambino, tra i sei mesi fino ad un anno di età, proprio nella fase in cui comincia a parlare, camminare e fare alcuni abbozzi che ripeterà continuamente da grande, ha anche la rivoluzione di capire che esiste nel mondo. Portato al ‘vetro magico’ questo bambino ‘cresciuto’, ha una interazione con lo specchio del tutto diversa… comincia a capire che quello che vede è se stesso, a toccarsi nelle zone che ritiene diverse dal solito, es macchie evidenti, sporco, colori che non gradisce. Anche di fronte alla televisione incomincia uno spirito di identificazione ed imitazione spinto proprio dai suoni.

Link video Spirito di Imitazione

Per quanto si sappia, questa è una caratteristica di pochissime specie animali, solo alcune scimmie e l’uomo (vedi post “Allo specchio“). Tuttavia solo la vista e l’udito possono stimolare questo istinto naturale.

Non vorrei entrare nel merito di questa strana e misteriosa maturazione nervosa che è ancora più colossale della nascita stessa del bambino, poiché non sto trattando solo di coscienza, linguaggio, equilibrio, voglia di interazione sociale ed una maturazione anche del carattere che avrà da grande, parlo anche di capacità di capire i suoni e dare a questi un significato. Insomma la rottura definitiva tra il vecchio mondo ancestrale e quello più evoluto e complesso degli esseri umani sapiens sapiens, ricco di emozioni, poesie, pensieri, riflessioni e rancori.

Nel prossimo post vedremo uno di questi piccoli ‘miracoli’ della vita, un argomento di neuroscienze, che è avvenuto in tanti bambini senza che ce ne rendiamo conto.

Conclusione

Qualcuno disse che “non è possibile cogliere un fiore senza turbare una stella” oppure “una farfalla che sbatte le ali in brasile crea una tempesta in un altro continente”. Bhé insomma, questo che abbiamo visto è un piccolo ‘dettaglio storico’ rappresentato dalla farfalla, nel prossimo post vedremo la perturbazione che ne consegue sul campo delle neuroscienze.

Continua: L’Orecchio: Assoluto o Relativo? (Parte II)

Pasquale

Ischemia Cerebrale (Parte V): Il maggiordomo

Qualcuno disse che non ci può essere giallo dove non ci sia anche il maggiordomo e la servitù. Il nostro poliziesco non ne è immune ovviamente, vediamo il proseguio delle indagini.

Preambolo

Continuiamo il nostro percorso in questo strano giallo, per chi non avesse seguito le puntate precedenti vi prego di visitare i seguenti links 1, 2, 3 e 4. Qui tratteremo un post di ‘transizione’, molto più semplice dei precedenti, ma che ci serve per capire i prossimi capitoli che saranno un po’ più complessi del solito.

Data la lunghezza eccessiva ho deciso di tagliare la storia in più sezioni, in questa vi presento la premessa (l’incontro). Come al solito sono bene accetti commenti di ogni tipo, suggerimenti per gli argomenti da trattare o migliorare.

La quiete dopo la tempesta

Come abbiamo visto nel precedente post, il nostro ispettore cellulare è stato improvvisamente freddato dallo scagionamento del primo imputato eccellente. La teoria iniziale non faceva una grinza e c’erano anche molti indizi pesanti contro l’accusato. Purtroppo con il tempo e con l’uso di sostanze sempre più specifiche per il blocco del fattore transcrizionale la teoria della difesa ha avuto sempre più supporto. HIF-1 non è sicuramente una proteina da mettere tra i cattivi per l’ischemia cerebrale. A quanto pare c’è stato un grosso fallimento da cui abbiamo imparato a non concludere facilmente le indagini prima di approfondirle con cura.

Siamo quindi costretti a ritornare sui nostri passi ed ricominciare le indagini dall’inizio con più zelo, cercando di raccogliere informazioni sempre più precise e concordanti su cosa stava accadendo ai neuroni poco prima di morire.

Direi di iniziare l’interrogatorio su tutti i possibili testimoni oculari o detentori di informazioni cruciali.

Dove trovare i colpevoli?

Pensare all’ipossia come innesco di un meccanismo che porterà a morte inevitabile per i neuroni non è male come teoria, tuttavia ci sono dei ricercatori che la pensano diversamente. Una volta, in un congresso un mio amico mi fece un’obbiezione inappellabile… per quanto possa essere interessante quel meccanismo che innesca la morte delle cellule, non c’è modo di evitarlo, un paziente arriva al pronto soccorso quando manifesta già i sintomi, ovvero quando c’è già stato “l’innesco letale”. Inoltre non è neanche possibile prevedere quando un individuo avrà un ictus, la nostra unica possibilità di aiutarlo risiede proprio in quella finestra di tempo che intercorre tra la comparsa dei sintomi e l’effettiva morte neuronale.

Se ci pensate è assurdo che le cellule siano ancora vive quando arrivano nelle nostre mani, e nonostante i nostri mezzi siamo incapaci evitarne la morte. Se vogliamo veramente fare qualcosa il primo punto dell’ordine del giorno deve essere fermare l’arma che ucciderà i neuroni, e solo dopo capire chi ha innescato il meccanismo ed è colpevole (scoprire il mandante).

Nel nostro caso dovremmo soffermarci sul perché le cellule non riescono più a gestire il calcio e muoiono. La soluzione di questo enigma sarà certamente correlata con la possibilità di salvare le cellule, mentre la cattura del mandante che ha scatenato la serie di eventi non servirà ad evitare nessun decesso cellulare al momento. Solo in un passaggio successivo potremmo chiarire anche chi ha causato tale massacro neuronale e perché.

Seguendo questa linea di pensiero in questo post ci concentreremo sui meccanismi di controllo e mantenimento dell’omeostasi ionica, cercando di fare il punto della situazione per poi trarne degli indizi.

La prima domanda è chi mantiene in ordine le concentrazioni ioniche intra ed extra cellulari?

Se fate questa domanda ad un qualsiasi esperto nel settore vi dirà che ci sono migliaia di proteine che fanno ‘ordine’ tra i diversi ioni, e sono divise in famiglie, superfamiglie e classi. Questi meccanismi possono dividersi grossolanamente in pompe e trasportatori, in base al fatto che usano direttamente, o no, l’ATP.

Tra le pompe più famose ci sono la Na⁺/K⁺ ATPasi che estrude sodio e fa entrare potassio, la pompa del calcio di membrana ed endoplasmatica (PMCA e SERCA), etc. Tra i trasportatori passivi i più noti sono lo scambiatore sodio/calcio (NCX), lo scambiatore sodio/calcio potassio (NCKX), lo scambiatore sodio/idrogeno (NHE), ed altri. Si tratta di un gruppo enorme di proteine che mettono continuamente in ordine i vari ioni, riportando continuamente le condizioni cellulari allo stato di riposo dopo le stimolazioni nervose che sono servite per attivare la cellula e per comunicare con il neurone successivo. E’ un po’ come avere delle cameriere e dei maggiordomi in una grande villa che mettono continuamente in ordine le camere ogni qual volta sono utilizzate.

Oggi ci concentreremo proprio su questi personaggi che stavano lì quando dalla calma apparente si è scatenata la disfatta neuronale.

La domanda ora è ‘Perché non hanno funzionato a dovere nel momento del bisogno?’

Vale la pena rispondere con chiarezza.

Prima domanda: Chi era in servizio durante l’ischemia e poco prima?

A questa domanda c’è una risposta più o meno ovvia. Poco prima dell’ischemia funzionava tutto come al solito, nulla lasciava presagire il disastro, e tutte le proteine risiedevano al loro nomale posto fino a che è mancata l’energia necessaria per il trasporto attivo degli ioni. Quando è iniziata a mancare l’energia l’efficienza del trasporto ionico si è ridotta mentre il disordine ionico dei neuroni aumentava. Poco dopo questa fase gli unici che potevano fare qualcosa erano gli scambiatori ionici che non necessitano di ATP, ma il destino della cellula era oramai segnato; senza ATP non si può andare avanti per molto. Poi d’improvviso è arrivata nuova energia e tutto è cominciato a rifunzionare alla normalità fino al danno irreparabile.

In questa indagine tutto è sottoposto alla lente di ingrandimento, e nulla è dato per scontato, quindi le dichiarazioni vanno convalidate e come al solito andiamo in laboratorio con una ricostruzione del delitto per cercare di confutare tali ipotesi. In questo caso potremmo ricorrere ad esperimenti in vitro fatto con delle cellule neuronali sottoposte a dei modelli di deprivazione di ossigeno e glucosio, seguito dalla riossigenazione. Si tratta ovviamente di un modello molto semplice, ma che ci evita di sacrificare animali, e consente un maggiore grado di controllo delle condizioni sperimentali. Effettivamente quando manca ATP funzionano solo i trasportatori passivi, e la loro capacità di controllare l’omeostasi ionica è discreta considerando le condizioni di emergenza. Inoltre nulla sembra cambiare nell’assetto dei vari trasportatori attivi e passivi, dopotutto non c’è abbastanza energia e tempo per cambiare le cose con una sintesi/degradazione proteica. I sistemi sono ri-settati all’essenziale ed a tutto quello che può aiutare a tamponare i danni o trarre energia.

Se tutte queste considerazioni sono vere dobbiamo escludere chi non poteva funzionare al momento dell’ictus e considerare invece solo chi poteva ed ha fatto qualcosa…

La prossima domanda è quindi: Chi funzionava al momento e cosa stava facendo?

NCX: il maggiordomo

A questo punto del racconto io mi recherei sul luogo del delitto alla ricerca di qualche indizio e soprattutto di qualche risposta.

Escludendo le pompe che fanno uso di ATP, tra i pochi trasportatori passivi che rimangono e che possono dare un consistente aiuto c’è lo scambiatore sodio/calcio (NCX).

Io immaginerei un ipotetico interrogatorio a questa proteina, magari in una stanza buia e fumosa.

Lei chi è?

NCX è una proteina di membrana fatta da circa 1.000 aminoacidi che è presente in tutte le cellule dei mammiferi e che fisiologicamente espelle il calcio citosolico in cambio dell’ingresso di sodio.

Da quanto tempo è in servizio?

In pratica quasi tutti gli organismi possiedono uno scambiatore del calcio, e sono tutti filogeneticamente collegati da un gene ancestrale che si è mantenuto molto conservato sia nella sua struttura che nella sua funzione. In altre parole è una proteina presente negli archeobatteri, funghi, piante, fino a tutte le cellule eucariotiche di mammifero, quindi una proteina davvero molto conservata…

Davvero notevole, ma mi dica… qual è la Sua funzione nel cervello e con chi collabora solitamente?

Sappiamo bene che, quando i neuroni si trovano a riposo, le concentrazioni ioniche sono mantenute soprattutto da pompe che fanno uso di energia sottoforma di ATP. In queste condizioni un trasportatore passivo come NCX funziona relativamente poco, poiché ha una bassa affinità per il calcio e per il sodio. Tuttavia le condizioni cambiano drasticamente dopo l’eccitazione neuronale, ovvero quando le concentrazioni di calcio citosolico aumentano improvvisamente a dismisura, le pompe si saturano e non riescono a riportare la cellula alle condizioni ioniche di riposo. In queste circostanze entrano in funzione NCX e proteine simili che hanno una bassa affinità per gli ioni, ma possono trasportarne enormi quantità in pochi istanti.

In pratica NCX espelle uno ione calcio mediante scambio con tre ioni sodio che entrano nella cellula, (proprio da questo deriva il suo nome).

Quindi Lei è specializzato nelle condizioni di ‘emergenza’, ovvero quando le pompe non riescono a mettere ordine… cosa mi sa dire riguardo all’ipossia? cosa stava facendo in quei momenti?

La risposta sarebbe ovvia. NCX stava espellendo il calcio dalle cellule sfruttando l’unica fonte di energia disponibile al momento ovvero il gradiente del sodio.

Perché?

Come già abbiamo accennato nei post precedenti il calcio è un ottimo segnale citosolico, ma quando supera certi livelli può causare disastri, quindi l’azione di NCX è in linea con le aspettative.

Ha visto qualcosa di strano in quei ‘momenti’? Può dirmi qualcosa a tal riguardo?

Quello che NCX ha visto è che la pompa del calcio in una prima fase era efficiente e riusciva a mantenere le concentrazioni di calcio citosolico a livelli estremamente bassi, ma riusciva ad espellere solo pochi ioni alla volta. Ad un certo punti si stava accumulando il calcio, la pompa è andata subito in saturazione e non riusciva ad espellere abbastanza ioni… poi è cominciata a mancare l’energia e l’efficienza di estrusione si è ridotta sempre di più. Si stava accumulando calcio citosolico oltre i normali livelli e tempi sopportabili per il neurone, per cui NCX è entrato in funzione ed ha espulso fino ad oltre 10.000 volte più ioni calcio nell’unità di tempo rispetto alla pompa in presenza di ATP, un fenomeno insomma.

…e cosa sa dirmi su cosa sia successo negli ultimi ‘istanti di agonia’? Alla fine è riuscito a tenere sotto controllo il calcio?

Effettivamente ci è riuscito parzialmente, poiché durante l’ipossia le concentrazioni di calcio si sono mantenute più o meno stabili per quanto fosse possibile farlo senza utilizzare ATP, e soprattutto fatto in così poco tempo… successivamente al ritorno dell’ossigeno tutto è tornato ad una apparente normalità; il livello di calcio citosolico è tornato nel suo normale range di concentrazioni citosoliche, quindi tutto ok, passata la tempesta è stato ovvio pensare che il peggio era oramai passato. Tuttavia, dopo un po’ qualcosa è cominciato ad andare sempre peggio, ci sono stati degli sbalzi di calcio improvvisi sempre più gravi, e la cellula si è resa conto ad un certo punto che non era possibile recuperare la situazione e si è arrivati all’inevitabile. Quei momenti sono stati talmente turbolenti che non è stato possibile capire cosa stesse succedendo.

Uhmm.. Per ora l’interrogatorio è finito, e diciamo che siamo soddisfatti delle informazioni raccolte…

Riepilogando, stiamo parlando di una proteina molto conservata, al che se ne potrebbe dedurre che il suo ruolo sia fondamentale per la sopravvivenza; insomma sembra interessante, ma purtroppo non sembra essersi aperta alcuna strada per noi. Praticamente non ci ha detto nulla.

C’è un’altra cosa…

Ritornando in ufficio c’è una cosa che non quadra… questo trasportatore passivo dove ha trovato tutta questa energia per espellere una quantità di calcio ionico così colossale? Una pompa del calcio consuma circa 1 ATP per 1 ione calcio, possibile che NCX abbia lavorato gratis contro ogni legge della termodinamica? In altre parole quanto è costato alla cellula questo ‘servizio’?

Ovviamente NCX ha sfruttato il gradiente di sodio tra l’ambiente extracellulare e quello intracellulare, ed in questo modo ha potuto espellere il pericoloso calcio dalla cellula scambiandolo con l’innocuo sodio…

Ma cosa succede a tutto quel sodio che NCX ha fatto entrare nella cellula e che non può essere espulso dalla pompa sodio/potassio?

Se sono stati necessari 3 ioni sodio per espellere ciascuno ione calcio, facendo dei semplici calcoli, a naso direi che nella cellula si sarà accumulato tanto di quel sodio da innescare altri meccanismi, ad esempio alterare il potenziale di membrana.

Se questo fosse vero la depolarizzazione causerebbe l’attivazione della cellula, con rilascio di neurotrasmettitori e conseguenze da definire. Sicuramente potremmo parzialmente spiegare l’ipereccitabilità, il calcio che rientra nuovamente nelle cellule e le onde di eccitazione neuronale che si espandono dal core ischemico.

La situazione non è molto chiara, e tornando alla centrale io darei un’occhiata allo schedario delle fedine penali, www.pubmed.gov , in cerca di cosa si sappia in giro di questo ‘maggiordomo’.

Da una rapida occhiata possiamo vedere che è correlato con numerosi meccanismi, NCX si lega con pompe e trasportatori ed esalta alcune caratteristiche dei canali ionici. Però qualcosa è più importante di tutto, è stato visto correlato con l’ischemia cardiaca; leggendo bene possiamo vedere che l’uso di farmaci che inibiscono l’attività di NCX diminuisce l’estensione della morte del miocardio in seguito all’infarto.

L’ipotesi è che la cellula si sia talmente indebitata di energia durante l’ipossia che al ripristino delle condizioni ottimali non ce n’è abbastanza per ristabilire il gradiente di sodio e reimpostare le condizioni di riposo. Un giro vizioso che può portare solo al disastro, come aver chiesto dei soldi ad uno strozzino.

Una crepa sul vetro cristallino di NCX: Calunnie?

Uhmm… Forse calunnie, leggendo bene qua e là i farmaci utilizzati per inibire NCX non sono molto specifici, agiscono anche su altri canali; magari NCX è stato coinvolto in qualcosa di più grande ed è stato usato come capro espiatorio. Improbabile che una proteina così letale possa essere conservata per milioni di anni durante l’evoluzione se non migliori sensibilmente il fitness dell’organismo.

Per dare una prova decisiva possiamo utilizzare, come tutti voi sapete, la prova del nove… un topo transgenico knock-out per NCX e verificare cosa succede.

In questo modello, infatti, se non ci sono variazioni dell’espressione degli altri canali/trasportatori c’è la massima specificità dell’inibizione di questa proteina… e quindi potremmo ufficialmente capire se si tratta di una proteina così cattiva.

Andiamo in lab e chiediamo di sviluppare il topo knock-out. Passano anni e qui il primo intoppo, il topo muore durante l’embriogenesi per mancato battito cardiaco. Si tratta di una scoperta senz’altro interessante ma sono anche anni di lavoro buttati al vento senza una risposta. Rifare tutto il lavoro daccapo e passare altri anni a sviluppare un altro topo? Uhmm…

Qualcuno ha suggerito una soluzione da fantascienza che potrebbe risolvere la situazione, ovvero utilizzare un virus in grado di infettare i cardiomiociti dell’embrione knock-out ed inserire in queste cellule il cDNA di NCX in maniera transiente… insomma abbastanza per attivare il battito cardiaco, poi successivamente l’espressione calerà di nuovo quando il topo non sarà più infettato.

Lo sviluppo della metodologia ha impiegato un paio di anni con risultati sconfortanti, il risultato è stato che l’espressione transiente di NCX nei cardiomiociti non serve a nulla. La mancanza di NCX è fondamentale per la vita dell’animale, probabilmente è necessaria l’espressione anche in altri tessuti (es le cellule pacemaker del cuore, di tipo nervoso), oppure è necessaria una espressione ancora più precoce della proteina, magari quando non si è ancora formato il primo abbozzo di cuore.

Disperati, si è ricorsi a strategie farmacologiche sempre più complesse, ma i risultati sono stati discordanti e dubbi; mancano sempre di selettività e specificità.

Il volo Pindarico

Le cose, da allora, non sono andate molto avanti, le pubblicazioni si sono rincorse tra di loro in un misto di ripetizioni e staccate con farmaci sempre più specifici e potenti. A questi articoli facevano seguito altri che descrivevano dell’effetto di queste sostanze sulla circolazione, ipertensione, inibizione di canali del calcio, respirazione mitocondriale, disaccoppiamenti mitocondriali etc etc.

Tuttavia per fare una buona ricerca c’è bisogno di determinazione, genialità ed anche un po’ di fortuna, tutte caratteristiche ben rappresentate nel padre di NCX, Kenneth Philipson, quando a sorpresa decide di intraprendere un nuovo e più Pindarico volo, investendo diversi anni nella generazione di un nuovo topo knock-out per NCX, ma questa volta condizionato (tecnica Cre/LoxP). Si tratta di una tecnica citata già più volte e che funziona bene, in poche parole il topo nascerà con una normale espressione di NCX in tutto l’organismo, poi ad un certo punto l’enzima Cre, come una bomba ad orologeria, eliminerà il gene di NCX solo nei cardiomiociti e darà un topo adulto privato improvvisamente di NCX.

Per i più curiosi il meccanismo sfrutta il cambio della catena pesante della miosina dei cardiomiociti subito dopo la pubertà. In questi topi transgenici insieme al promotore della catena pesante della miosina c’è una ricombinasi che andrà a distruggere il gene ncx causando un knock-out tessuto e tempo specifico.

Non vi dico del rischio che il topo muoia proprio quando la proteina verrà a mancare e vanificare ancora una volta il lavoro di anni di sacrifici.

Passarono degli anni e finalmente eravamo arrivati vicino al fatidico momento, la nascita del primo topo transgenico. Da quel momento devo dire che c’è stata una lunga agonia misto di silenzio ed impazienza aspettando quel fatidico momento in cui un topolino che ha in sé tutte le promesse di questo mondo deve passare per quell’unico istante in cui diventerà knock-out e dimostrerà al mondo se è possibile vivere senza una specifica proteina cardiaca.

Purtroppo capita anche di affezionarsi ad un animale che vivendo darà inconsapevolmente un enorme contributo alla ricerca. I giorni passavano ed il topo alla sua maturità sessuale era ancora vivo e vitale, le analisi non hanno dimostrato anomalie cardiache e tutto procede come nulla fosse. Così è stato anche per le nidiate successive e la biochimica ha dato l’ok, questi topi adulti hanno un knock-out cardiaco. Si decide di fare l’ischemia cardiaca e il risultato è stato sconcertante. La mancanza di NCX nel cuore provoca un’entità del danno al miocardio pari al 50% circa rispetto ai topi wild-type.

NCX è sicuramente colpevole… un fulmine nel cielo sereno, una pubblicazione che cambierà definitivamente la storia di questo trasportatore.

Su questo modello animale sono stati poi tentati tantissimi esperimenti, soprattutto con quei farmaci così potenti e specifici per NCX; i risultati hanno dimostrato in maniera incontrovertibile che gli effetti ottenuti erano dovuti all’azione su altre proteine, è stato solo un caso che l’uso di queste sostanze dimostrano gli stessi effetti del knock-out per NCX.

Quello che succede al cuore succede anche al cervello?

Analisi su analisi in diverse salse hanno dimostrato che questa proteina è fondamentale per alcuni meccanismi cardiaci e non solo, ma sicuramente esalta anche il danno ischemico al miocardio. E’ una circostanza difficile da spiegare in termini evoluzionistici e non è possibile capirne a fondo il meccanismo esatto.

Qualcuno fa notare che sia l’eccesso di ioni sodio durante il lavoro di NCX a causare danno per osmosi; tre ioni sodio per miliardi di ioni calcio determinerebbero uno squilibrio osmotico che liserebbe la membrana cellulare formando prima delle bolle sulla superficie e poi la rottura fino alla morte.

Ovviamente la trasposizione al cervello è immediata, se fa male al cuore potrebbe far male anche ai neuroni?

La situazione non è semplice, abbiamo diverse opzioni per verificare questa ipotesi e nessuna di queste è facile.

L’esperimento più determinante potrebbe essere, come al solito, la generazione di un knock-out per NCX nel cervello, però si corre nuovamente il rischio di un nuovo tonfo in acqua, poiché potrebbe mancare l’embriogenesi del SNC e quindi aborto precoce. Se questo dovesse avvenire avremmo speso tempo e denaro inutilmente, per non parlare delle sofferenze indotte sugli animali.

D’altra parte fare dei knock-out tessuto specifico, soprattutto per il cervello, è difficile, lungo e dispendioso; per ora accantoniamo l’idea fino a che non sia strettamente necessario.

Potremmo ricorrere a dei saggi alternativi per chiarire la situazione, e magari li vediamo nella prossima puntata.

Conclusione

Si potrebbe definire serendipità: cercare un ago in un pagliaio e trovarci la figlia del contadino (Julius H. Comroe).

Stavamo brancolando nel buio in cerca di prove e ci siamo scontrati con un pregiudicato per il danno cardiaco ischemico camuffato da semplice faccendiere delle pulizie da calcio.

Nelle prossime puntate analizzeremo meglio il personaggio, il suo ruolo nel cuore e poi nel cervello, cercheremo nuove prove a cui ovviamente farà seguito il ‘processo’ per concorso in neuro-omicidio.

Alla prossima

Pasquale

Preambolo

Finalmente le tanto meritate vacanze sono iniziate anche per me, e colgo l’occasione per finire finalmente questo post in elaborazione oramai da tanto tempo, come al solito cortesemente corretto da Valentina. Qui descriverò un argomento abbastanza lungo, difficile e ’spigoloso’ per i profani ed esperti, anche se penso che tutti lo conoscono almeno un po’ per sentito dire.

Parleremo dell’olfatto, un argomento non facile da raccontare in un post divulgativo senza ’smussare’ qua e là il mosaico di teorie e di esperimenti che sono stati fatti fino ad ora.

L’Olfatto: Alcuni dettagli ovvi

Come al solito mi servirò inizialmente di qualche punto di riferimento per metterci d’accordo ed inizierò dagli odori che sono causati, come tutti voi sapete, da molecole sprigionate dalle sostanze e disperse nell’aria che respiriamo, dove raggiungono il nostro naso. L’altro punto di riferimento utile si trova subito dietro il naso e sopra la volta della nostra cavità buccale dove passano tutte le molecole che noi respiriamo. E’ una cavità rivestita da una mucosa di circa 10 cm² che attraverso la solubilizzazione, la dispersione, l’adsorbimento e quant altro, ferma una porzione delle molecole che si trovano nello stadio aeriforme nella cavità nasale e le disperde nel fluido mucoso. Qui le molecole possono incontrare una o più cellule recettoriali olfattive (ORC), in un uomo adulto se ne contano circa 10-20 milioni, ricche di propagini dette ciglia e di proteine dette recettori olfattivi (da qui chiamate Odorant Receptor OR).

I OR hanno il compito ‘legare’ in maniera più o meno specifica alcuni gruppi funzionali di queste molecole presenti nel fluido mucoso, ed innescare una cascata di eventi che si amplifica fino ad attivare la cellula recettrice e scatenare la propagazione del ’segnale odoroso’. Il cervello, a sua volta, provvederà ad interpretare il segnale in diversi stadi con una serie di meccanismi molto complessi. Per dettagli ed approfondimenti potete guardare questo link.

Fin qui il tutto è quasi scontato ed ovvio, però dalla teoria alla pratica c’è una notevole differenza, vi dico subito che ancora oggi ci sono vari lati oscuri che cercherò di descrivervi in parole semplici, portandovi ai problemi scientifici in maniera intuitiva per quanto sia nelle mie capacità.

Quanti odori esistono?

Come penso molti di voi possono intuire, esiste un numero inimmaginabile di odori, e la maggioranza di questi è causato da un mix di ‘odori primari’ in diversi rapporti, ma a complicare la situazione c’è che una molecola odorosa può agire su decine di recettori diversi con diversa specificità. I OR dei composti aminici, ad esempio, riconoscono solamente l’azoto primario, secondario o terziario con diversa efficacia, per cui gli odori di questi composti non possono essere discriminati con facilità e sembrano tutti molto simili. C’è da dire però che nonostante questa piccola sovrapposizione di segnali si possono discriminare con elevata sensibilità circa 10.000 odori diversi.

Ciò premesso, consentitemi da questo punto in poi di semplificare e di concentrarci esclusivamente sugli ‘odori primari‘ che sono riconosciuti quasi esclusivamente da un solo tipo di OR e che danno una sensazione odorosa molto precisa.

Cosa c’è di difficile?

Nel mondo animale, il non saper distinguere l’odore di una preda dall’odore del proprio predatore fa la differenza tra fare una buona colazione ed essere la colazione di qualcun altro. Anche riconoscere l’odore delle cose che si possono mangiare da quelle che è meglio evitare è fondamentale per la sopravvivenza, quindi i mammiferi durante l’evoluzione hanno accumulato più di 1.000 geni che sovraintendono il più misterioso dei 5 sensi. In pratica più del 3% del genoma dei mammiferi è deputato alla percezione degli odori, e dato che questi recettori possono riconoscere anche più tipologie di molecole con diversa affinità determinando una combinazione di interazioni intermedie, questo amplifica esponenzialmente il ventaglio di sensazioni che possono dare le molecole presenti nell’aria.

La chiave di volta per ottenere un buon olfatto è sicuramente il collegamento tra le cellule recettoriali odorose (ORC) ed il cervello, ovvero quel meccanismo che consente di poter capire quale specifico OR è stato attivato. Si tratta di un meccanismo per nulla banale, e come punto di riferimento, possiamo considerare l’esempio del gusto, dove i recettori cellulari sono generati in base alla localizzazione sulla superficie della lingua. Nel cervello si forma una sorta di correlazione tra aree specifiche corticali ed aree della lingua denominata ‘mappa sensoriale‘. A questo consegue che è possibile percepire il salato, l’amaro, il dolce ed l’acido in base a quale zona della lingua è stata stimolata maggiormente.

Possiamo trasportare questa ipotesi nell’olfatto, ed immaginare che l’area in cui si trovano le ORC determina anche il set di recettori da esprimere. Ipotizziamo che ciascuna cellula recettrice dell’olfatto possa esprimere un centinaio o più OR localizzati in diverse aree della mucosa nasale. Ogni area in cui vi sono le ORC potrebbe essere correlata ad una zona del cervello a cui corrisponderebbero determinate sensazioni odorose.

Quanti recettori per cellula?

Sapere quanti tipi di recettori sono presenti per cellula è fondamentale per capire quante aree ci dovremmo aspettare di trovare e per verificarlo potremmo ricorrere a tecniche avanzatissime di in situ hybridization, e di retrotrascrizione ed amplificazione per PCR su singola cellula. Ovviamente non sono tecniche facili e nemmeno tanto diffuse, ma gli esperti sono riusciti a dimostrare con questi esperimenti che ogni ORC esprime solamente un singolo OR.

Una cosa simile avviene durante il differenziamento cellulare, dove la combinazione di alcuni fattori trascrizionali decide l’attivazione di meccanismi sempre più specializzati che ‘bloccano’ l’espressione  specifica di determinati geni. Questo meccanismo, definito ‘deterministico’, è quello maggiormente utilizzato durante la specializzazione cellulare nel nostro organismo. Potremmo ipotizzare un meccanismo simile per le ORC in cui dalla combinazione di alcuni fattori trascrizionali si determina l’attivazione dell’espressione di un singolo OR.

Verifica della Teoria Deterministica

Secondo questa teoria la combinazione casuale o pseudocasuale di fattori trascrizionali per esprimere un singolo OR non può essere disturbata dalla coespressione di un OR transgenico scelto da noi. Per verificare questa teoria ‘deterministica‘, quindi, possiamo generare un topo transgenico in cui alcune ORC esprimono in maniera forzata un determinato OR scelto da noi e valutare se c’è coespressione.

Il risultato è interessante, non c’è alcuna sovrapposizione di segnali tra il OR espresso forzatamente da noi ed un qualsiasi altro recettore olfattivo endogeno. In pratica l’espressione forzata del nostro OR transgenico non permette di esprimere un qualsiasi altro OR endogeno, e se si tenta di generare un topo transgenico con una espressione forzata di due OR diversi nella stessa ORC, queste muoiono per apoptosi. Questi dati non sono di certo a supporto per la teoria deterministica, evidentemente la scelta del recettore olfattivo è un meccanismo molto più complesso. Ad aggiungere benzina sul fuoco c’è un’altra prova interessante, ovvero le ORC possono cambiare più volte il recettore odoroso espresso prima di prendere contatto con il cervello (maturazione cellulare). La teoria deterministica è molto fallace con questi risultati, poco probabile che sia quella buona.

La Teoria Stocastica

Un’altra teoria che si è fatta strada nel tempo è basata sulla casualità della scelta del OR espresso (teoria stocastica). Per capirci immaginiamo un fattore trascrizionale  unico che sia in grado di legare il promotore di tutti i geni dei OR e di consentirne l’espressione; tecnicamente può legarsi ad un solo OR e quindi può esprimere solo quello. Se il fattore trascrizionale non è molto efficiente nell’esprimere un OR si potrebbe spiegare come mai una ORC cambia OR nei primi stadi pur seguendo sempre la regola di esprimere un solo OR alla volta. In seguito, quando un OR espresso dà un forte segnale di funzione (feed-back) il fattore trascrizionale si fissa sul gene che sta trascrivendo fino allo stadio di maturazione.

E’ una teoria che funziona e che spiega anche i risultati dei topi transgenici; il OR transgenico blocca l’espressione di altri recettori attraverso un feed-back abberrante. Però, come al solito la teoria va convalidata, e c’è l’imbarazzo della scelta sul come; una prova schiacciante potrebbe derivare dall’eliminazione del feed-back recettoriale. In particolare potremmo alterare un gene OR in modo tale da codificare un recettore non funzionante pur conservandone la struttura genica.

I risultati dimostrano che il topo transgenico non esprime mai un OR non funzionante, probabilmente proprio per la mancanza del feed-back del recettore maturo necessario per fissare la scelta. Per esserne sicuri, è stata effettuata una controprova per dimostrare che le ORC tentano di esprimere il OR non funzionante, e che solo successivamente cambiano la scelta su un altro gene OR che funzioni. Per dimostrarlo si è generato un topo transgenico in cui l’espressione anche transiente del recettore non funzionante provoca un danno irreversibile al DNA della stessa cellula (tecnica Cre/LoxP), ed i risultati hanno mostrato che le ORC scelgono il OR transgenico e non funzionante con la stessa probabilità di tutti gli altri OR, sebbene questa scelta sia cambiata prima della maturazione cellulare per mancanza di feed-back. Un’altra prova conclusiva e schiacciante è che la generazione di un topo trangenico che esprime un OR esogeno e non funzionante non disturba l’espressione dei OR endogeni. Questo dimostra che è la funzione di un OR a bloccare l’espressione dei OR endogeni, non la struttura e l’espressione dei geni OR endogeni.

La spina nel fianco per la Teoria Stocastica

La teoria stocastica fino ad ora ha sempre soddisfatto tutti i dati sperimentali ottenuti, ma ciononostante ha un punto debolissimo. Questa teoria è retta dalla possibilità di poter innescare la trascrizione di qualsiasi dei 1.000 geni dei OR da uno o pochi fattori trascrizionali, e questo sarebbe possibile solo nel caso in cui i geni OR presentino una sequenza consenso che li identifichi nel genoma. Ebbene, nonostante molti ricercatori si siano impegnati nell’analisi di omologie di sequenze tra i geni degli OR, i risultati ottenuti sono stati alquanto deludenti; con i dati attuali si potrebbero raggruppare non più di una decina di geni degli OR per volta tirando in ballo meccanismi di riconoscimento improbabili.

E se fossero dei Linfociti?

Se ci pensate, esiste un meccanismo di scelta molto simile che avviene nei linfociti. Queste cellule, però, non decidono l’anticorpo da esprimere in base a fattori trascrizionali, ma attraverso una ricombinazione genetica guidata. Si tratta di una piccola deviazione della teoria stocastica ed è anche risolutiva.

Come al solito dobbiamo convalidare tale teoria… ed escludiamo subito la proposta di sequenziare l’intero genoma di singole cellule, sarebbe difficilissimo e ci vorrebbero tanti anni! Possiamo ricorrere ad un trucco chiamato FISH (fluorescent in situ hybridization), ovvero rendere fluorescente una sonda ad RNA verso un introne di un OR. In questa tecnica non è possibile valutare una ricombinazione genica in maniera diretta, tuttavia è possibile localizzare dove inizia la trascrizione di un determinato gene all’interno del nucleo e valutare se, in seguito ad una ricombinazione, cambia posizione. I risultati, alquanto discutibili, dimostrano che il sito di inizio della trascrizione avviene sempre nello stesso punto del nucleo e del genoma, quindi niente ricombinazione, ma c’è una novità inaspettata; la trascrizione di un OR proviene solamente da un singolo allele.

Sbrogliare la matassa di informazioni non è mai facile

Spesso nella ricerca è importante definire delle ipotesi e porsi le domande giuste, ovvero cercare di identificare la cosa più importante di un meccanismo e trarne quante più informazioni possibili per verifica e deduzione. Nel nostro caso la codifica di un singolo allele, cioè solo 1 delle due copie genetiche di un OR, è ancora in linea con la teoria della ricombinazione genetica, poiché se è vero che la scelta è casuale, questa non può avvenire in entrambi gli alleli fratelli allo stesso modo. Inoltre se l’inizio della trascrizione avviene sempre nello stesso punto, questo non esclude che tutto il resto del DNA (es il promotore) possa essere stato ricombinato.

L’ipotesi che ne scaturisce è questa: La cellula sceglie un OR da esprimere in modo casuale, in mancanza di un feed-back funzionale cambia scelta, in seguito, alla maturazione cellulare la scelta diventa definitiva mediante ricombinazione di un promotore o di segnali a monte dell’OR scelto. Questa ipotesi potrebbe spiegare come mai l’espressione forzata di un recettore esogeno possa bloccare l’espressione dei recettori endogeni; probabilmente la proteina inserita provoca un feed-back che innesca una ricombinazione abberrante del DNA nei OR endogeni. La teoria per ora tiene ma con le parole non si dimostra mai niente, è fondamentale convalidare la teoria e questa volta non è per nulla facile evidenziare tante piccole ricombinazioni in singole cellule di 20 micron di diametro circa.

Come dimostrare una ricombinazione che si possa trovare in un qualsiasi punto del genoma? In questo caso il test di validazione è non semplicissimo. L’idea è che la ricombinazione del DNA in una ORC provocherebbe il blocco dell’espressione di un determinato OR in tutte le condizioni, come avviene per un linfocita. Se da questo DNA ricombinato si clonasse il topo stesso da cui deriva… l’animale che risulterebbe dovrebbe esprimere solo un OR, poiché il suo DNA è già ricombinato in maniera irreversibile. I risultati sono stati scioccanti, il topo che ne risulta è perfettamente sano e ha tutto l’apparato olfattivo intatto e funzionante come in un qualsiasi wild-type. Nonostante l’analisi di circa 100 kb a monte ed a valle del gene incriminato non c’è stata nessuna modifica genetica o epigenetica.

Basta un soffio ed il castello crolla

Certamente la ricombinazione è da scartare ma fino ad ora niente ha smentito la casualità della scelta del OR. Tuttavia un gruppo di ricerca ha recentemente messo in discussione anche questa ipotesi granitica.

L’idea di fondo è la seguente… Se è vero che la cellula sceglie casualmente un gene su circa 1.000, e di questo solo 1 allele, ne consegue che la scelta è di 1 sui 2.000 alleli disponibili. Se riuscissimo ad inattivare solo 1 di questi 2.000 alleli, ad esempio in modo tale che esprima irreversibilmente EGFP (tecnica Cre/loxP), potremmo rendere fluorescenti le cellule che hanno ‘cambiato idea’ per mancanza di feed-back e verificare quale altro gene sceglie dei 1.999 rimanenti.

Il risultato, ancora una volta, è assolutamente strabiliante. Il topo transgenico presenta una coespressione di EGFP solo con il suo allele funzionante corrispondente. In poche parole l’espressione di EGFP, come previsto, non dà feed-back positivo per cui la cellula cambia OR da esprimere; ma la seconda scelta non è per niente casuale, qualcosa guida la scelta sull’allele di ‘backup’ presente sul cromosoma fratello e non sugli altri 1.998 alleli rimanenti. Come potrebbe la cellula riconoscere in modo specifico l’altro allele se la scelta è basata solo sulla casualità? Qualcosa non quadra, ed in questo modo la casualità che ha retto la teoria stocastica fino ad ora è stata, almeno parzialmente, distrutta in un soffio.

L’olfatto che guida l’assone durante il lungo cammino

L’ultima domanda è ‘Cosa succede con il collegamento al cervello quando forziamo una cellula ORC ad esprimere un recettore specifico scelto da noi?’. Gli esperimenti mostrano che il collegamento cervello-recettore è perfetto, quindi ne consegue che il collegamento è basato solo sull’OR espresso.

Ma quando questa scelta cambia all’improvviso?

Per rispondere a questa domanda un gruppo di ricercatori ha tentato di cambiare il recettore scelto dalla cellula poco prima che questa riesca ad ‘agganciarsi’ al cervello (maturare), attraverso un gene OR esogeno ed inducibile.

In questo topo transgenico le ORC scelgono un recettore endogeno in un modo apparentemente casuale, e cominciano la propagazione dell’assone verso il cervello cercando la zona giusta per formare sinapsi. Durante questa fase si può innescare l’espressione del recettore transgenico con il conseguentemente spegnimento del recettore endogeno…

La cellula ancora immatura, come abbiamo visto, si ‘adatta’ al nuovo recettore, ma si aggancerà anche alla zona cerebrale giusta? La risposta è incredibilmente sì. il collegamento e la funzione del recettore è perfetto nonostante il cambio recettoriale durante la formazione dell’assone. Tuttavia, se si cerca di cambiare la scelta dell’OR espresso dopo la maturazione della ORC, si provoca una abberrazione che innesca apoptosi.

Come è possibile che un OR possa guidare la scelta della regione cerebrale giusta a cui ‘agganciarsi’ senza avere altri 1.000 geni deputati al riconoscimento dei diversi OR da parte del cervello?

Qualcuno ha suggerito un’ipotesi alquanto affascinante, secondo cui un OR si trovi alla testa dell’assone durante la fase di elongazione, guidandolo verso il corretto punto di aggancio al cervello come farebbe un cane da tartufo a portarci verso questo prezioso tubero in un intero bosco.

Teoria affascinante e stravagante, tuttavia ancora insoluta ed in cerca di qualcuno che la convalidi o la controbatta con esperimenti, o con ipotesi più semplici.

Conclusione

In questo lungo post abbiamo messo sul piatto tutto quello che è noto sull’olfatto senza uscirne fuori con una teoria solida in grado di spiegare tutti i dati sperimentali. Per chi fa ricerca questo risultato è il pane quotidiano poiché non si seguono mai strade battute, si cerca sempre di crearne nuove, con nuove ipotesi, nuove verifiche e nuove deduzioni che porteranno ad altre ipotesi che si spera siano migliori delle precedenti e più vicine alla verità.

Tutt’ora ci sono gruppi di ricerca che analizzano le seguenze di DNA dei recettori OR cercando qualcosa in comune; analisti in cerca di modifiche epigenetiche in questi clusters genomici; cacciatori di nuovi meccanismi cellulari; esperti di transgeni che tentano nuove e più affascinanti teorie, a volte anche bizzarre… e poi ci sono ricercatori che provano a dare un senso a questo puzzle di dati disarmonici. Il tutto per svelare un mistero che dura da tanti anni oramai.

Non vi è dubbio che ci sono persone che provano un certo fascino nel partecipare a questa continua caccia alla soluzione del problema strato dopo strato, tirando fuori teorie sempre più complesse ed affascinanti, ed a volte come in questo caso si tirano fuori addirittura nuovi meccanismi che si ignoravano fino a poco tempo fa.

Un in bocca al lupo a chi si addentrerà nel risolvere questo mistero anche solo per 5 minuti ed un grazie a Nico e Patrizio per l’incoraggiamento ed i consigli che mi hanno dato per la stesura di questo post.

Pasquale

Rieccoci ancora per un’altra puntata per la divulgazione scientifica sull’ischemia cerebrale. Questo che vedremo è, in ordine cronologico, l’ultimo capitolo da me scritto ma il primo da me adattato per la pubblicazione di questa serie. Il motivo è che, a parer mio, potrebbe essere più intuitivo per le persone che non si sono mai affacciati ad un discorso scientifico impegnato. Trattasi di circa 15 anni di ricerche in questo campo seguito e presentato per lo più in ordine cronologico con qualche inesattezza o approssimazione in qualche punto per rendere il discorso quanto più scorrevole e divulgativo possibile; Vogliate scusarmi se in qualche caso ho semplificato un po’ troppo quanto si conosce realmente in letteratura.

Preambolo

Per chi non avesse seguito il percorso del nostro misterioso ‘giallo’ sull’ischemia cerebrale forse sarebbe bene leggersi i capitoli precedenti per poter seguire meglio questo ‘racconto’

http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=26

http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=37

http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=41

Siamo nelle vesti di un improbabile investigatore molecolare con il compito di risolvere un misterioso omicidio di cellule neuronali in seguito ad ictus. Fino ad ora abbiamo cercato di ricostruire la vita dei neuroni, le ultime ore delle vittime e come si presentano agli occhi della scena del crimine. In questo capitolo, invece, cercheremo di puntare il dito sul primo imputato eccellente dell’ischemia, ovvero un fattore trascrizionale ‘particolare’. Già la sola appartenenza di una proteina alla categoria “fattore trascrizionale” conferisce quell’alone di mistero ed ambiguità tipico, infatti, è noto che queste proteine frequentano “strane compagnie”, tale che il più amabile difensore della vitalità cellulare può trasformarsi nel peggior nemico da abbattere nelle neoplasie.

Ecco a voi quanto segue.

La prima pista delle indagini

Una delle osservazioni più ovvie che mi sono state fatte nel tempo si basa sul fatto che tutto quello che si avvia durante l’ischemia cerebrale è senza alcun dubbio innescato dalla mancanza di ossigeno e nutrimento… secondo questa ipotesi ci si dovrebbe concentrare sugli eventi che sono attivati dall’ipossia e/o glucopenia per arrivare al vero meccanismo che innesca la morte neuronale ritardata. L’osservazione è ottima, e tantissimi ricercatori si sono concentrati su questa pista per trovare i responsabili.

Sicuramente uno dei target più dibattuti in questo contesto è il fattore trascrizionale che porta il nome di Hypoxia Inducible Factor (HIF), ovvero fattore indotto dall’ipossia. Ce ne sono 3, chiamati HIF-1, HIF-2 e HIF-3; di questi solo il primo è noto alla maggioranza della comunità scientifica, e sembra essere il più importante.

Quale personaggio per HIF-1?

Se dovessi associare questo fattore trascrizionale ad un personaggio di un giallo, potrebbe essere rappresentato senza alcun dubbio da un antipatico ed ambiguo individuo che attira su di sé tutti gli indizi, in modo tale che rappresenti l’assassino nell’immaginario del lettore per buona parte del racconto. In genere queste persone durante il racconto possono trovarsi alternativamente tra i principali sospetti, tra i fiancheggiatori, tra gli innocenti o tra i più improbabili difensori della verità.

Assassino, complice, arma, ancora di salvezza e persino futile perdita di energia… queste sono le definizioni che nel tempo sono state associate a questo strano fattore trascrizionale.

I Primi indizi ed il primo incontro

La pista dell’ipossia ci porta a chiedere se la scena del crimine era frequentata da fattori che sono proprio regolati da questa condizione. Da un elenco di proteine potremmo scorgere un personaggio molto influente definito HIF-1 e già qui giungiamo al primo mistero; dall’analisi della zona ischemica emerge chiaramente che HIF-1 non è presente al momento del ‘delitto neuronale’, un semplice Western Blot per l’analisi delle proteine mostra chiaramente una debolissima banda di HIF-1 ma niente di più di quello che si troverebbe in un qualsiasi tessuto in condizioni normali. Il personaggio quindi sembra non avere indizi a carico, tuttavia ci sono delle stranezze da puntualizzare.

Tiriamo fuori il nostro asso nella manica, ovvero la ricostruzione dell’avvenimento in un modello di ischemia su animale ed analizziamo la quantità di HIF-1 in diverse aree cerebrali a diversi tempi dopo l’occlusione dell’arteria cerebrale media. Dai risultati ci renderemo conto che HIF-1 non era presente prima dell’occlusione e neanche all’inizio dell’occlusione stessa, mentre è presente per pochissimo tempo durante l’ipossia neuronale per poi sparire di nuovo improvvisamente subito dopo il ripristino del circolo sanguigno.

HIF-1 dovrebbe spiegarci molte cose al riguardo sul perché c’era, cosa ha fatto e come ha fatto ad apparire e scomparire velocemente in circostanze quantomeno sospette.

Il mago Houdinì – Apparizioni e Sparizioni

HIF-1 è un fattore trascrizionale composto da due sub-unità definite HIF-1alfa e HIF-1beta, prodotti da due geni diversi molto conservati nell’evoluzione dei mammiferi. La trascrizione e la formazione di queste due proteine sono costanti ed ubiquitari in tutto l’organismo, tuttavia con un banale western blot non è possibile vedere una buona dose di proteina nei tessuti.

Il perché è subito chiarito dal suo scopritore Gregg Semenza, che ha dimostrato come in condizioni di ossigenazione ‘normale’ HIF-1alfa è idrossilato attraverso un enzima e poi processato per la degradazione… in poche parole HIF-1alfa è continuamente prodotto ma è anche degradato subito dopo in presenza di ossigeno molecolare. Infatti, quando l’ossigeno comincia a mancare HIF-1alfa non si può più degradare e si accumula legandosi al suo cofattore HIF-1beta formando il fattore trascrizionale completo HIF-1 che va ad attivare una serie di geni target. In seguito alla riossigenazione HIF-1alfa è nuovamente degradato ed il complesso HIF-1 non si forma più.

Ecco così spiegato il mistero della sparizione ed apparizione di HIF-1 durante l’ischemia cerebrale.

Conosci gli amici che frequenti e saprai chi sei

La domanda più interessante a questo punto è “quali geni target attiva HIF-1?”. Bhé ce ne sono centinaia, e sono divisi in classi secondo il meccanismo globale a cui afferiscono.

Troviamo geni del metabolismo anaerobico del glucosio, ovvero quegli enzimi che servono per ottenere energia dal glucosio senza la necessità di ossigeno, troviamo anche geni che servono per aumentare l’ossigenazione in una certa regione del tessuto come ad esempio VEGF il fattore che induce la vascolarizzazione in loco per apportare più ossigeno e nutrienti. Tra i target c’è anche l’eritropoietina che aumenta la produzione di globuli rossi che portano l’ossigeno in tutto l’organismo.

Poi ci sono geni un po’ più strani che mirano comunque alla sopravvivenza della cellula in condizioni anaerobiche e geni di cui non si sa bene la funzione nell’ipossia.

Tutto sommato è un ‘buono’ e serve alle cellule per ‘adattarsi’ alle scarse riserve di ossigeno e soprattutto promuovere il rimodellamento dell’organismo per avere più ossigeno.

Buono?

C’è anche l’altra faccia della medaglia, come per ogni fattore trascrizionale. L’altra faccia della ‘Janus Face’ HIF-1 è che se passa ‘dall’altra parte’ favorisce la vascolarizzazione di neoplasie (tumori) rendendolo più maligno e più resistente alle terapie antineoplastiche. Non a caso le mutazioni dei geni che servono per degradare HIF-1 in presenza di ossigeno siano dei noti oncogeni, ovvero geni cruciali che favoriscono la formazione e l’accrescimento dei tumori quando non funzionano a dovere.

Cosa ci faceva HIF-1 durante l’ischemia?

Bene dopo questa velocissima presentazione di questo angelo o diavolo è ora di chiedersi cosa stava facendo subito dopo l’occlusione dell’arteria cerebrale e proprio in quei neuroni che moriranno diverse ore dopo… Stava avvelenando il loro futuro o stava costituendo un disperato tentativo di salvataggio?

Se provate a chiedere a HIF-1 cosa stesse facendo la risposta è ovvia, stava promovendo la sintesi di geni del metabolismo anaerobico per consentire ai neuroni di far fronte all’immediata assenza di ossigeno.

Facendo una Cromatin Immunoprecipitation (ChIP), ovvero una tecnica che ci permette di determinare se un fattore trascrizionale è legato o no ad una determinata regione genomica, c’è un primo riscontro positivo, effettivamente HIF-1 si trovava nelle posizioni di attivazione dei geni che servono per il metabolismo anaerobico.

Però c’è un’incongruenza, il tempo necessario ad HIF-1 per attivare i geni del metabolismo è costituito almeno da diverse ore; ovvero il tempo necessario per aumentare la sintesi di mRNA e di proteine. HIF-1, invece, rimane legato ai geni descritti per pochissimo tempo, al massimo un’ora o anche molto meno, un tempo che non basterebbe neanche a reclutare tutti i cofattori necessari per l’attivazione della trascrizione genica… come mai?

HIF-1 si difende esponendo i propri fatti… ovvero si trovava lì al momento dell’ipossia, aveva visto che ‘la nave stava affondando nell’ipossia’ e quindi si è attivato quanto prima come da suo dovere, poi è subentrata la riossigenazione dell’area cerebrale che lui non poteva prevedere ed è stato degradato dall’ossigeno prima che potesse fare effettivamente qualcosa. Per cui in realtà si tratterebbe di un tentativo andato a vuoto.

Dall’analisi per RT-PCR, tecnica che permette di determinare l’aumento o la diminuzione dell’espressione di determinati geni, c’è una prima conferma dell’alibi di HIF-1. Effettivamente stavano aumentando, seppur di poco, la sintesi dei geni implicati nel metabolismo anaerobico, del tutto sovrapponibile con quello che ci si aspetterebbe dall’azione esplicata da HIF-1.

Innocente allora?

Prima di prosciogliere l’imputato io suggerirei di analizzare anche chi ha frequentato HIF-1 in quella notte misteriosa dove è avvenuta l’ipossia. C’erano altri geni che ha indotto HIF-1?

Un gene molto importante è VEGF come già accennato, implicato nell’induzione della vascolarizzazione a lungo termine, ma che ha anche un’azione neuroprotettiva acuta nei confronti dell’ischemia cerebrale. Poi ci sono l’eritropoietina, che serve per aumentare i globuli rossi nel sangue, anch’esso neuroprotettivo in fase acuta, e tanti altri geni più o meno noti per avere un’azione neuroprotettiva. Un eroe dunque.

Il lato oscuro di HIF-1

C’è però anche chi fa notare che i fattori trascrizionali in condizioni non fisiologiche come l’ischemia cerebrale possono frequentare anche ‘compagnie diverse’ ed insolite da quelle catalogate. Infatti, da alcuni esperimenti di Microarray, tecnica che permette di vedere l’aumento o la diminuzione dell’espressione di un ampio numero di geni in condizioni fisiologiche rispetto a quelle patologiche, è emerso che HIF-1 ha scarsamente indotto geni neuroprotettivi, come già descritto, però durante la sua attivazione sono aumentati enormemente anche tanti geni di ‘malaffare’.

Insomma tanto basta per iniziare il processo contro questo ’strano individuo’

Che il processo abbia inizio… entri il primo imputato HIF-1

La parola all’accusa

Quei pochi minuti che bastano

Sebbene siano necessarie diverse ore per attivare i geni del metabolismo anaerobico, per HIF-1 sono stati necessari pochi minuti per attivare alcuni dei geni più distruttivi dell’ischemia. E non si tratta di una piccolo aumento di espressione. Il gene in questione è la nitrossido sintetasi inducibile che produce radicali liberi sottoforma di gas nitrossido con un’azione neurotossica letale per i neuroni. Da un’analisi con Decoy, ovvero la somministrazione di piccoli tratti di DNA a doppio filamento che simulano il sito di legame di HIF-1 e lo sequestrano lontano dai geni bersaglio, è stato possibile determinare con certezza che HIF-1 è il principale responsabile dell’aumento della trascrizione della iNOS. Quando ad una cellula ipossica si dà il Decoy, HIF-1 lo lega e non riesce a raggiungere il gene bersaglio, un effetto simile ad un knock-out genico. La iNOS è nota per causare la morte cellulare dei neuroni, una questione indubbia.

Ma come è possibile che ad HIF-1 bastino pochi minuti per l’attivazione di iNOS mentre sono necessarie ore per i geni neuroprotettivi? Greeg Semenza è riuscito a chiarire anche questo altro aspetto. HIF-1, infatti, è prodotto continuamente dalla cellula, ed è anche degradato continuamente, ma una piccola quota di HIF-1 è presente nelle cellule, visibile per western blot, e basta per legare ed indurre determinati geni insoliti. Talvolta li lega anche quando non c’è ipossia ed attende la mancanza di ossigeno così per trovarsi già in loco quando serve.

Insomma HIF-1 è stato visto aumentare e fomentare geni per la degenerazione neuronale, mentre i geni neuroprotettivi non erano stati trattati allo stesso modo, dando solo un’apparenza di eroe salvatore.

A carico di HIF-1 c’è anche la precisione di espressione proprio nei neuroni e nei luoghi dove ci sarà, diverse ore la sua scomparsa, la maggior percentuale di neuroni morti. Una coincidenza forse?

Insomma, la situazione si è messa male per HIF-1, le prove vanno decisamente contro; il legame degli enzimi metabolici e neuroprotettivi potrebbe essere solo una copertura per il vero scopo, ovvero la degenerazione dei neuroni?

La parola alla difesa

La difesa tira fuori il dogma scientifico

Il Dogma scientifico

Per chi non lo sapesse, esiste un dogma per ogni disciplina culturale umana e la biologia non ne è immune. Il Dogma dei biologi è che niente succede a caso, poiché per ogni gene o proteina ci sono milioni di anni di evoluzione che raffina tutti i meccanismi a quelli fondamentali per la sopravvivenza e per l’evoluzione. Se ci fosse qualcosa di inutile o peggiorativo sarebbe eliminato automaticamente dall’evoluzione stessa. Per cui la selezione e la conservazione di un fattore indotto dall’ipossia che causi morte nei neuroni non è credibile poiché non darebbe un vantaggio per la sopravvivenza.

Dopotutto quello che si vede è una sommatoria di tantissimi meccanismi che interagiscono tra di loro e quello che si osserva è solo la summa del tutto da cui è difficile estrapolare un singolo messaggio. Meglio ricorrere all’incidente probatorio…

Ovvero spegniamo HIF-1 con un knock-out genico ed induciamo l’ischemia, verifichiamo in questo caso se l’animale che manca di questo fattore è più o meno esposto al danno neuronale rispetto agli animali wild-type.

L’incidente probatorio o la prova del nove

La prova più importante seguita da quella definitiva molto spesso è la generazione di un topo knock-out per il gene di interesse. Ci sono stati tantissimi esempi di questo tipo, vale sia come inizio di una ricerca per capire grossolanamente un gene di cosa sia responsabile e vale anche come prova raffinata per avere la prova definitiva che un determinato gene sia coinvolto in un certo meccanismo.

Purtroppo nonostante intensi sforzi per ottenere topi knock-out per HIF-1alfa, è emerso che un animale privato di questo gene non riesce a svilupparsi ed a sopravvivere ai primi stadi embrionali, anche se è esposto ad  un normale livello di ossigenazione. Ovviamente questo è stato il motivo dei ritardi nel fare un topo transgenico e quindi definire una prova evidente del suo ruolo in tanti processi fisiologici e patologici.

Tuttavia, recentemente è stato possibile generare un topo con un knock-out tessuto specifico di HIF-1alfa per i neuroni, il risultato è stato quantomeno sorprendente… l’assenza di HIF-1alfa durante l’ischemia cerebrale ha enormemente potenziato i danni neuronali.

Un fulmine a ciel sereno per tutti… L’imputato è senza dubbio da scagionare e da mettere tra i difensori cellulari.

Conclusioni

In questo capitolo abbiamo visto un esempio di imputato eccellente dell’ischemia cerebrale che ancora oggi per alcuni gruppi di ricerca rappresenta ancora il centro dell’attenzione. Gli studi andranno sicuramente avanti, anche se non ci si aspetterebbe ancora molto da quanto descritto, HIF-1alfa nel processo dell’ischemia cerebrale si potrebbe definire almeno non pericoloso tanto quanto altri imputati eccellenti che vedremo nelle prossime puntate. Per questi motivi l’attenzione su questo fattore trascrizionale si è concentrato soprattutto sulle neoplasie, ed ha tralasciato progressivamente l’ischemia cerebrale, renale e cardiaca. Vedremo se qualcuno in futuro troverà qualche prova rilevante per riaprire nuovamente il processo. In attesa di tale data ci rivedremo nella prossima puntata dove vedremo un altro imputato importante.

Tags: fattori trascrizionali, HIF-1, HIF-1alfa, Ictus, Ischemia Cerebrale, Mente, Neuroscienze

Ciao a tutti! Oggi vi parlerò di un articolo che non tratta strettamente le neuroscienze, ma che propone una tecnica che sicuramente potrà trovare interessanti risvolti in questo campo. Questo post è la traduzione (abbastanza fedele) di quello che ho scritto originariamente (in inglese) sull’ottimo blog ReporterGene.

Uno dei vantaggi dell’utilizzo di indicatori codificati geneticamente è quello di poterli utilizzare per l’imaging in vivo e quindi per studiare processi fisiologici (o patologici) in un sistema molto più completo (e complesso) di -per esempio- una coltura cellulare o una fettina di tessuto.

Diversi approcci sono stati utilizzati per ottenere imaging in vivo, alcuni dei quali fanno uso di una fibra ottica, o “fibroscopio”, inserita nella regione da analizzare e collegata ad un microscopio. Questo è ovviamente un metodo invasivo, e limita l’osservazione alla piccola zona d’azione della fibra. Un altro approccio meno invasivo è quello di utilizzare obiettivi a lunga distanza focale per ottenere immagini di una regione del corpo esposta: come già visto, questo metodo è stato usato, ad esempio, per analizzare la plasticità delle spine dendritiche nella corteccia cerebrale. Anche questa tecnica, tuttavia, permette la visione di una limitata area di interesse, oltre a richiedere un intervento chirurgico piuttosto delicato.

L’approccio recentemente descritto da Rogers e colleghi su PlOS One, invece, è completamente non invasivo. Hanno infatti generato una linea di topi transgenici che esprimono in maniera selettiva (tamite un approccio floxed-stop) una proteina sensibile al calcio, detta GFP-aequorina. Il reporter può essere espresso selettivamente nelle cellule di interesse semplicemente incrociando questi topi con topi che esprimono Cre in quelle cellule (molte di queste linee sono disponibili commercialmente). La GFP-aequorina è una proteina che consiste di una parte sensibile al calcio (aequorina) che in presenza di ioni Ca²⁺ può ossidare un substrato (chiamato coelenterazina), producendo luminescenza, la quale eccita l’altra metà della proteina (GFP, green fluorescent protein) che quindi fluoresce.

L’idea è quindi quella di iniettare coelenterazina e misurare la fluorescenza generata da GFP.
Questo metodo permette di osservare variazioni di calcio nell’intero animale, anche se ovviamente ha una risoluzione spazio-temporale più bassa (ma comunque buona) rispetto agli altri metodi sopra menzionati.

E in effetti sembra che funzioni bene! Quando GFP-aequorin è stata espressa nei mitocondri delle cellule muscolari, infatti, ha permesso di misurare l’aumento di calcio durante la contrazione muscolare. Questo è stato testato sia dopo una contrazione introdotta artificialmente, sia in condizioni fisiologiche come l’attività muscolare spontanea di topi neonati (vedi figura), sia in situazioni “patologiche”, come le convulsioni evocate da kainato.

Per meglio vedere questo sistema in azione consiglio fortemente di guardare i  video allegati all’articolo (che come tutti gli articoli di PLoS è ad accesso gratuito).

Riassumendo, questo approccio permette di misurare il calcio in modo non invasivo e su tutto l’animale in condizioni fisiologiche e patologiche. Questa tecnica potrebbe trovare interessanti applicazioni in studi che misurano lo stato metabolico di un certo tessuto, o l’apoptosi o uno dei moltissimi processi regolati dal calcio (la memoria ad esempio). Il passo successivo, ovviamente, sarebbe quello di ottenere questo tipo di registrazioni in un sistema in cui l’animale si può muovere liberamente. Se avete visitato il link qui a sinistra avrete capito che non siamo lontani dall’ottenerlo, ed infatti lo stesso gruppo ha già pubblicato un articolo a riguardo (Roncali et al., J. Biomed. Opt. 2008)!

Preambolo

Carissimi,

recentemente mi è capitato di incontrare una patologia rara, che ignoravo fino a poco tempo fa, e  che ha innescato in me pensieri e teorie contrastanti a cui non saprei dare un giusto ordine.

Per capirci, come al solito, c’è bisogno di fare un po’ d’ordine nel linguaggio. Il punto d’origine dei nostri assi cartesiani verbali in questo post sarà la parola ‘Normale’ che identifica, senza ombra di dubbio, una qualsiasi caratteristica che si presenta nella quasi totalità della popolazione. Da questo ‘punto zero’ potremmo allontanarci definendo un maggiore o minore grado di ‘anormalità’. Si potrebbe persino tracciare un asse con una direzione per ‘anormalità buone’ e ‘cattive’ e deporre in queste due zone tutte le possibili caratteristiche che ci fanno allontanare dalla normalità. Questa semplificazione, purtroppo, ci porta ad un limite, cioè per quanto ci potremmo sforzare alcune ‘anormalità’ potrebbero essere difficili da sistemare. Per intenderci, tutti noi saremmo certamente lieti di essere ‘anormalmente intelligenti e forti’, molto meno per ‘anormalmente bassi e brutti’. Tuttavia, alcune di queste certezze sarebbero perse quando dovremmo ipoteticamente posizionare in questo contesto la sindrome di Asperger.

Cosa è la Sindrome di Asperger?

Cosa è la Sindrome di Asperger?

Si potrebbe definire come un innato disordine del comportamento, ma è difficile avere una definizione di questa patologia in due parole, forse potrebbe essere meglio considerata semplicemente come un insieme di sintomi con una maggiore o minore gravità.

Se vi dicessi che alcuni studiosi pensano che Michelangelo, Wittgenstein, Kurt Gödel, Glenn Gould, Bobby Fischer, Satoshi Tajiri, The Vines Craig Nicholls, Albert Einstein e Isaac Newton soffrissero in qualche misura di questa ‘sindrome anormale’ e che proprio questa caratteristica donasse loro un qualcosa in più rispetto alla ‘normalità’?

Se tutto questo fosse vero, lo stesso concetto di ‘malattia’ o ‘sindrome’ si rivaluterebbe in qualcosa di assolutamente meraviglioso, anzi molti si precipiterebbero ad informarsi su come potersi ‘ammalare’ di questa ‘anormalità’.

L’anormalità è quindi positiva? Come ho già accennato non si tratta di una cosa semplice, poiché la malattia in questione è la sindrome di Asperger, un disordine psicologico che secondo alcuni appartiene alle mille sfaccettature dell’autismo. Già il concetto di autismo è di difficile comprensione, e la sindrome di Asperger sembra esserne una ulteriore complicazione, poiché prende alcune delle peggiori caratteristiche dell’autismo con le più belle caratteristiche che l’umanità possa desiderare in una complessa macchina psicologica completamente impenetrabile ad una semplice analisi.

Vi prego di non immaginare che le persone affette da questa ‘anormalità’ appaiono chiuse e taciturne come Dustin Hoffman in Rain Man; tutt’altro, la loro facilità di linguaggio è tale da poter essere definiti “iperlessici”. Si può dire anche che hanno un raro e sviluppato senso dell’umorismo, con un’abilità non comune per capire e creare doppi sensi, giochi linguistici, satira ed altro. Le persone con la sindrome di Asperger, inoltre, appaiono come delle persone molto intelligenti ed in molti casi dei veri e propri geni. Sono immersi nella società e spesso fanno dei lavori molto impegnativi e che richiedono una particolare intelligenza, cultura o concentrazione; ad esempio architettura, ingegneria, programmazione informatica e persino la chirurgia medica. Persone abbastanza ‘normali’ per trovarsi immersi nella società, ma abbastanza speciali per non essere classificati come persone mediocri anche se spesso non si rendono conto di essere così speciali.

I soggetti ‘malati’ della sindrome di Asperger sono spesso attratti, con un intenso livello di attenzione, solo da determinate cose che interessano loro e da attività in cui si possa ritrovare un certo ordine come le classificazioni, liste e simili.

L’individuo può portare avanti anche una vita di successo, poiché spesso manifesta ragionamenti estremamente sofisticati, un’attenzione pressoché ossessiva e una memoria eidetica, ovvero focalizzata sulle immagini visuali e sui dettagli, utile ad esempio nella chirurgia.

Ma allora cos’è che manca? Perché si definisce come sindrome?

L’altra faccia della medaglia

Ovviamente tutto ha un prezzo, e queste persone pagano un prezzo altissimo per queste straordinarie ‘anormalità’. Quello che manca a loro è un’innata abilità di capire ed esprimere gli stati emotivi con gesti, linguaggio corporeo ed espressione facciale.

Le persone affette da sindrome di Asperger, sebbene non manchino di intelligenza e capacità linguistiche, appaiono incapaci di comprendere il significato di semplici segnali come un sorriso, che magari può essere interpretato come una semplice smorfia più che un segno di gradimento. Mancano, inoltre, dell’abilità di capire ciò che non viene detto esplicitamente ed in pari modo essi hanno difficoltà a comunicare con accuratezza il loro proprio stato emotivo.

Mentre la maggioranza delle persone al mondo si trova più o meno nella media per qualunque caratteristica fisica o psichica e di conseguenza non brilla per nessuna di queste, i bambini affetti da questa strana sindrome, invece, brillano come ‘piccoli professori’ in materie a loro piacevoli da studiare e spesso potrebbero mettere in difficoltà anche persone di livello universitario su determinati argomenti per cultura, profondità di pensiero e spiccato senso critico. Tutta questa straordinaria capacità di concentrazione, intelligenza, genialità, cultura, passione per lo studio e per la ricerca, però, è impotente di fronte alla capacità di percepire gli stati mentali degli altri a livello cognitivo ed emotivo. Le persone con la sindrome di Asperger possono osservare un sorriso e non capire se si tratti di un segno di comprensione, di accondiscendenza o di malizia, e nei casi più gravi non riescono neppure a distinguere la differenza tra sorriso, ammiccamento e altre espressioni non-verbali di comunicazione interpersonale. Per loro è estremamente difficile saper “leggere attraverso le righe”, ovvero capire quello che una persona afferma implicitamente senza dirlo direttamente.

Bisogna comunque notare che, trattandosi di un disturbo con ampio spettro di variazione, una certa percentuale di individui con la sindrome di Asperger appaiono quasi normali nella loro capacità di leggere le espressioni facciali e le intenzioni degli altri. Molti di questi inconsapevoli geni, infatti, non sanno neanche di essere affetto da una forma lieve di questa patologia, mentre altri più gravi mostrano difficoltà anche nel guardare negli occhi le altre persone, ritenendolo pericoloso e al di sopra delle proprie possibilità, oppure hanno un contatto visivo eccessivamente fisso, che può essere avvertito come “disturbante” per le persone comuni.

Genialità: Croce e Delizia

Bisogna parlare anche della parte più oscura della sindrome di Asperger che come avrete intuito non dà quello che si potrebbe definire una vita tutta rose e fiori. Spesso può portare al soggetto molti problemi nelle interazioni sociali tra persone di pari livello. Un bambino affetto da tale sindrome, ad esempio, ha difficoltà a decodificare i segnali impliciti su cui si reggono le interazioni sociali e può essere messo da parte dai coetanei, generando un’alienazione sociale talmente intensa che il bambino può arrivare a creare degli amici immaginari per sentirsi in compagnia.

I problemi proseguono anche nella vita adulta, molti individui con la sindrome di Asperger, infatti, non possono avere una vita considerata socialmente appagante dalla gente comune, molti infatti rimangono pressoché soli, anche se è possibile che stringano strette relazioni con alcuni individui.

Stiamo trattando di una patologia con un diverso grado di severità, quindi si troveranno anche molte persone, che soffrendo di questo disturbo, si sono sposate e hanno avuto figli; i loro bambini possono essere persone comuni o soffrire di qualche disturbo di tipo autistico.

Tutt’oggi la causa della sindrome di Asperger non è ancora nota, anche se si sa che c’è una forte influenza genetica e non ci sono differenze neurologiche confrontati ai soggetti così detti ‘normali’.

I soggetti non hanno avuto alcun trauma evidente da piccoli, non sviluppano un ritardo nel parlare e non manca il desiderio di comunicare con l’esterno.

Tutto sommato le persone con la sindrome di Asperger sono vittime inconsapevoli dei lati oscuri della genialità, sono più facili a cadere in una forma depressiva rispetto alla popolazione generale perché essi hanno spesso difficoltà a comunicare problemi o capire quando è il momento di mostrare affetto. Amano come gli individui ‘normali’, e forse di più perché spesso sono soli, ma sono molto letterali nel parlare e hanno difficoltà nel comunicare in maniera emozionale, e frequentemente possono instillare nella propria compagna insicurezza e confusione.

Riflessioni

Malattia quindi? o dono divino? Un fardello, appesantito dalla solitudine, da portare sulle spalle o semplici effetti collaterali della genialità?

Sicuramente le persone con la sindrome di Asperger non si potrebbero definire come semplici pazienti da ‘curare’, ma persone con grandi doti di intelligenza che possono contribuire attivamente allo sviluppo della società e della civiltà, come è già successo in passato. Il trattamento per la sindrome di Asperger, quindi, non c’è, ma attualmente si cerca di migliorare gli effetti collaterali che questi sintomi possono procurare. Poiché in fondo, spesso sono persone che hanno solo bisogno di essere accettati per le proprie caratteristiche. Come un non vedente che vuole dalla società un mondo più accessibile per non esserne escluso… allo stesso modo c’è chi non legge le espressioni degli altri e vorrebbe la stessa cosa. Immaginate chi si dovrebbe definire portatore di handicap… Un genio che ‘non vede’ le espressioni del viso? Oppure le persone ‘normali’ che hanno un intelletto più limitato?

Forse in questo caso la definizione ‘diversamente abile’ sarebbe più azzeccata che mai.

Pasquale

La ricostruzione della scena del crimine

Allora, per chi non avesse seguito le puntate precedenti, abbiamo introdotto un giallo misterioso dove delle cellule del cervello umano muoiono improvvisamente in seguito ad ischemia cerebrale (icutus), mentre noi siamo la polizia scientifica molecolare nominati per cercare di spiegare cosa sia accaduto in quegli istanti e determinare chi ha causato la morte neuronale.

Per chi non avesse seguito le parti precedenti dia uno sguardo ad i seguenti links Ischemia Cerebrale (Parte I) Ischemia Cerebrale (Parte II)

Fino ad ora il nostro taccuino è quasi vuoto, sappiamo ancora poco e ci sono ancora tante cose da analizzare. Se fossimo degli zelanti ispettori, una delle prime cose da fare potrebbe essere ricostruire le ultime ore delle vittime per capire chi poteva trovarsi là al momento del delitto. In questo caso potremmo usare dei modelli cellulari (in vitro) o animali (in vivo) per riprodurre quello che succede nell’ictus umano. La scelta del modello non è banale, anzi è fondamentale per poter chiarire qualcosa. In genere si hanno due strade davanti ed in base a questa scelta dipenderà il livello di difficoltà che si dovrà affrontare.

La prima strada è la scelta di modelli cellulari (in vitro) che danno dei dati semplicemente misurabili ed abbastanza riproducibili; tutto sommato è un sistema semplicissimo da affrontare, ma d’altra parte ci accorgeremo presto che questi modelli sono un’eccessiva semplificazione di quello che avviene nell’uomo e che quindi ci sono anche delle notevoli limitazioni.

La seconda strada, invece, è la scelta di un modello animale (in vivo) che riproduce con molta fedeltà quello che avviene sull’uomo, ma è difficile da capire ed analizzare in tutti i suoi dettagli, proprio perché più simili al danno umano.

Ci sarebbe anche una terza strada definita ex vivo oppure colture organo tipiche, in cui si coltivano interi tessuti o parti di organi prelevati dall’animale vivo per avere una maggiore complessità rispetto alle semplici cellule, ma un vantaggio di semplificazione rispetto all’animale intero.

Le ultime ore delle vittime

Quello che si fa è prendere un certo numero di animali, ad esempio topi o ratti, ed indurre in questi l’ictus attraverso l’occlusione di una arteria cerebrale importante. Ogni animale potrebbe essere analizzato in tempi diversi così da ricostruire gli eventi che seguono l’occlusione sanguigna e precedono il danno finale.

I risultati sono interessanti, poiché è subito evidente che non tutte le cellule neuronali muoiono contemporaneamente; il volume ischemico si espande da una zona più vicina all’occlusione sanguigna fino ad arrivare ad un massimo di espansione a circa 24 ore dal danno. In ogni momento potremmo riconoscere una zona prevalentemente necrotica con poche cellule vive (core ischemico) ed una zona circostante in sofferenza che diverrà ben presto anch’essa morta (penombra ischemica).

L’onda killer

Se dovessimo ricostruire cosa accade negli ultimi istanti di queste cellule, ci potremmo accorgere che le cellule della penombra moriranno entro qualche ora non riescono a gestire i flussi di calcio citosolico (vedi primo post). Il calcio si accumula nelle cellule poiché queste non hanno energia a sufficienza per pomparlo fuori; di conseguenza le cellule sono più facilmente eccitabili e possono attivarsi anche in momenti non opportuni, liberando neurotrasmettitori che eccitano altre cellule come un’onda di scariche elettriche longitudinali che si propagano dal centro dell’ischemia fino alla periferia del cervello. Proprio in questi momenti, ovvero poco prima della morte cellulare, si possono avere dei corto circuiti neuronali e l’avvio di sistemi di ripristino di emergenza nella metà cerebrale colpita. Questi corto circuiti generano i classici segni premonitori che si possono riassumere nell’acronimo inglese FAST

• Faccia asimmetrica (ad es. una palpebra più bassa, o una bocca storta): ciascuna metà del nostro organismo è gestita da una metà cerebrale, se in una di queste ultime avvengono corto circuiti oppure entrano in funzione sistemi di emergenza, la faccia o il corpo può avere un’asimmetria.
• Arti asimmetrici: si sollevano entrambe le braccia con i palmi rivolti verso l’alto, poi si chiudono gli occhi e si mantiene questa posizione per qualche secondo, nell’ictus un braccio tende a scendere per lo stesso motivo precedente
• Suoni confusi o distorti: Se le scariche elettriche colpiscono il centro del linguaggio, il paziente potrebbe essere colto da afasia con emissione di parole confuse, suoni distorti o potrebbe pensare di parlare correttamente mentre farfuglia parole a caso.
• Tempo: se si notano anche uno solo dei sintomi precedenti non bisogna esitare, una cura tempestiva è fondamentale per una buona riuscita della terapia.

Questi sintomi, infatti, compaiono ben prima che avvenga la morte dei neuroni, quindi sono ancora del tutto reversibili se si riesce a ripristinare la circolazione cerebrale.

Il paziente potrebbe anche avere all’improvviso

• debolezza o insensibilità o comparsa di formicolii a una metà del volto, a un braccio o a una gamba oppure a tutta la metà del corpo
• oscuramento o perdita della visione da un solo occhio
• incapacità di esprimersi o di comprendere qualcuno che parla
• inspiegabile sensazione di vertigine, capogiro, sbandamento o cadute improvvise
• grave e inspiegabile mal di testa.

Se questi sintomi scompaiono entro 24 ore, al paziente verrà detto che ha avuto un Transient Ischemic Attack (TIA), cioè un attacco ischemico transitorio, in pratica un ictus minore, dovuto a una occlusione solo transitoria di un vaso arterioso.

Primo intervento

Se il paziente colpito da icuts ha la fortuna avere vicino qualcuno che sa riconoscere i sintomi e riesce a portarlo in pronto soccorso entro le 3 ore dall’occlusione dell’arteria cerebrale, allora i medici potrebbero somministrare al paziente del tPA, ovvero l’attivatore tissutale del plasminogeno, in grado di degradare il trombo che ha occluso un’arteria e ridare ossigeno alle cellule neuronali prima che sia troppo tardi. Altra alternativa altrettanto valida è inserire un palloncino nell’arteria occlusa per gonfiarlo nell’ostruzione e liberare il circolo sanguigno.

Quando invece è già troppo tardi succede un qualcosa di irreversibile o quasi. Questo impercettibile punto di non ritorno che avviene dopo le prime 3 ore nell’uomo e ben prima che incominci la morte neuronale è l’oggetto della nostra contesa.

Fino ad oggi, infatti, non esistono metodologie che riescano in qualche modo ad identificare il perché le cellule neuronali muoiano anche se ricevono ossigeno, metaboliti e sostanze trofiche, e non si riesce a capire neanche quanto sarà esteso il danno, quali cellule moriranno e soprattutto quale zone saranno interessate. Ai familiari del paziente, infatti, verrà detto che bisognerà aspettare 1-2 giorni per capire quanto esteso è il danno e quali zone del cervello interesserà.

Questo aspetto è il punto cruciale, in queste ore che precedono il danno le cellule sono vive e ci servirebbe capire perché muoiono per poi cercare disperatamente un metodo per bloccare tale procedura apparentemente irreversibile.

Analisi della scena del crimine

Un ispettore che si trova in una scena del crimine molto complessa come quella descritta e che ha sentito la ricostruzione del danno analizzerebbe sicuramente tutta una batteria di proteine e di mRNA per capire costa stavano facendo i neuroni in quei momenti. Questa analisi ovviamente può essere fatta da una ipotetica polizia scientifica utilizzando, ad esempio, la metodica dei microarray.

I microarray sono dei piccoli chips della grandezza della punta del nostro indice con cui è possibile valutare l’aumento o la diminuzione dell’espressione dell’mRNA di tantissimi geni contemporaneamente attraverso l’uso di un estratto di RNA da un controllo ed un estratto di RNA da un trattato.

Per chi non conosce i chips può leggere qui Microarray – Wikipedia

Tecnicamente questa metodica ci consente di guardare sommariamente tra i nostri 30.000 geni, quali sono aumentati o diminuiti in seguito ad un determinato stimolo, farmaco, malattia etc etc.

Questa metodica, infatti, si addice benissimo ad avere una visione globale del problema per incominciare un percorso di indagine sui responsabili della patologia.

Noi potremmo utilizzare questa metodica per analizzare zone analoghe del cervello in un animale ischemico e confrontarlo con un animale shame-operated, ovvero un animale che ha ricevuto una procedura chirurgica simile ma che non ha avuto l’occlusione di un arteria. Questo è importante poiché dobbiamo evitare alcune interferenze dovute allo stress operatorio, ad eventuali infiammazioni o infezioni. Dall’analisi emerge che sono variati almeno 7.000 geni.

Abbiamo quindi 7.000 testimoni o potenziali imputati da valutare con attenzione singolarmente o in gruppo nel processo che si sta aprendo, a cui si dovrebbero aggiungere anche altri imputati eccellenti che non possono essere valutati con i microarray, ad esempio neurotrasmettitori, sostanze endogene, ioni, meccanismi post-traduzionali (su proteine) che possono alterare l’espressione di una proteina, e la sua funzione senza interferire in alcun modo sulla sua espressione.

Conclusione

In questo ultimo post introduttivo abbiamo presentato un piccolo bagliore della difficoltà di questo lungo ed inesauribile processo verso ignoti che causano ogni anno una invalidità più o meno grave fino alla morte di tantissime persone nei paesi industrializzati. Per utilizzare un termine moderno si potrebbe parlare di un maxi-processo in cui gli imputati sono tra loro correlate con gerarchie complesse. Come già accennato, gli imputati sono in realtà numericamente molti di più di 7.000, ma fortunatamente non li prenderemo in considerazione tutti nel nostro blog; vedremo solo alcuni personaggi perché interessanti, ambigui, fortemente sospettati, antipatici, schivi o semplicemente perché si trovava lì al momento del delitto.

Alla prossima puntata.

Pasquale